Методика выполнения измерений массовой концентрации органических кислот в напитках методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
Свидетельство №24-08 от 04.03.2008, ФР.1.31.2008.01732
1. Объекты исследования
Настоящая методика выполнения измерений распространяется на вина виноградные, оригинальные и плодовые, напитки винные, соки и сокосодержащие напитки, виноматериалы виноградные и плодовые, сусла; и устанавливает определение массовой концентрации органических кислот (щавелевой, уксусной, лимонной, винной, яблочной, суммы молочной и янтарной) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
2. Диапазон измерений
Метод обеспечивает получение результатов измерений массовой концентрации определяемых органических кислот в пробах напитков в диапазонах, представленных в таблице 1.
Таблица 1. Диапазоны измерения массовой концентрации органических кислот в пробе напитка.
| Анализируемая кислота | Диапазон измерения массовой концентрации, мг/л |
|---|---|
| Щавелевая кислота | 50-500 |
| Лимонная кислота | 100-4000 |
| Винная кислота | 500-3000 |
| Янтарная и молочная кислоты (сумма) |
500-5000 |
| Яблочная кислота | 100-5000 |
| Уксусная кислота | 100-3000 |
3. Пробоподготовка
Отбор проб вина, винных напитков, соков и сокосодержащих напитков, виноматериалов, сусла осуществляют в стеклянные емкости, предварительно вымытые и тщательно высушенные.
Пробоподготовка проб вина, винных напитков, соков и сокосодержащих напитков, виноматериалов, сусла состоит из стадий отбора пробы, разбавления пробы водой бидистиллированной в два раза, проведения процесса твердофазной экстракции ТФЭ части разбавленной пробы (1/5 по объему) на картриджах strata C18-T.
При наличии взвешенных частиц отобранную пробу предварительно центрифугируют, супернатант (надосадочную жидкость) фильтруют с помощью одноразового шприца через фильтрующую нейлоновую насадку, очищенную пробу разбавляют водой бидистиллированной в два раза, проводят твердофазную экстракцию ТФЭ части разбавленной пробы (1/5 по объему) на картриджах strata C18-T.
Хранение проб производят в стеклянных емкостях.
Блок-схема процедуры пробоподготовки
4. Проведение хроматографического анализа
4.1. Оборудование и условия для проведения ВЭЖХ-анализа градуировочных растворов органических кислот, подготовленной пробы воды.
Для хроматографического разделения органических кислот необходимо использовать изократическую высокоэффективную хроматографическую систему со спектрофотометрическим детектированием в УФ-области.
Для проведения анализа предварительно готовят градуировочные растворы из навесок кислот; проводят пробоподготовку; подготавливают к работе прибор.
Оборудование:
- хроматограф жидкостный «Стайер М» с спектрофотометрическим детектором;
- персональный компьютер с установленным программным обеспечением «МультиХром».
Условия:
- изократический режим;
- колонка: Rezex ROA-Organic Acid 300х7,8 мм 8 мкм (Phenomenex, США);
- защитная колонка: Carbo-H+ 4х3,0 мм (Phenomenex, США);
- подвижная фаза: 0,005 N раствор серной кислоты;
- скорость потока: 0,5 мл/мин;
- объем петли: 20 мкл;
- детектирование: спектрофотометрическое, длина волны 210 нм
* При длине волны 254 нм детектируется пик сорбиновой кислоты, отклик пика бензойной кислоты очень слабый. Поэтому, при анализе бензойной кислоты, а также смеси сорбиновой и бензойной кислот детектирование следует проводить при длине волны 230 нм.
В рамках данной методики возможно определение таких компонентов как кофеин, аспартам, сахарин. При необходимости измерения их содержания в напитках, наряду с сорбиновой и бензойной кислотами, выбор длины волны детектирования обусловлен наличием в образце сильно окрашенных пищевых красителей.
Градуировку проводят по градуировочным растворам (во всем диапазоне определяемых концентраций) не реже 1 раза в квартал, а также при использовании новой партии реактивов, замене колонок и после ремонта хроматографа.
4.2. Определение количественного содержания органических кислот в пробе напитка.
Для определения количественного содержания компонентов пробы (органических кислот) проводят хроматографический анализ одного из градуировочных растворов и далее хроматографический анализ подготовленной пробы. Для достоверности измерений хроматографический анализ как градуировочного раствора, так и подготовленной пробы проводят не менее 2 раз подряд.
При использовании программного обеспечения «МультиХром» в отчете или над пиком (в зависимости от установок опций «ВИД») по окончании измерения автоматически определяется результат в виде концентрации определяемых кислот. Для получения результата необходимо провести два параллельных измерения (получить две хроматограммы).
За результат измерений принимают среднее арифметическое значение из двух параллельных измерений умноженное на два, т.к. в процессе пробоподготовки производилось разбавление исходной пробы в два раза.
1. Основное оборудование
Хроматограф жидкостный «Стайер М» по ТУ 4215-032-81696414-12 в составе:
- насос изократический в стальном исполнении (SS 316);
- детектор спектрофотометрический UVV-105;
- устройство ввода образца (ручной инжектор или автосамплер);
- дозатор петлевой объемом 20 мкл;
- необходимый стартовый набор капилляров, фитингов и уплотнений для сборки системы и обеспечения работы в течение гарантийного периода (в полимерном исполнении);
- шприц дозирующий Hamilton для ввода образца объёмом 100 мкл;
- хроматографическая колонка Rezex ROA-Organic Acid 300х7,8 мм 8 мкм в комплекте с защитной колонкой Carbo-H+ 4х3,0 мм и держателем (Phenomenex);
- программное обеспечение для сбора и обработки данных «МультиХром».
2. Вспомогательное оборудование и оборудование для пробоподготовки
- Персональный компьютер (процессор Intel Core i3 или более производительный, объём оперативной памяти не менее 8 Гб, последовательный порт или MOXA) с установленной операционной системой Windows 10, монитор, лазерный принтер.
- Устройство для фильтрации и дегазации растворов и фильтры мембранные (фторопластовые). Предназначены для подготовки подвижной фазы в хроматографическом анализе, подключаются к водоструйному или вакуумному насосу.
- Вакуумная установка для твердофазной экстракции (ТФЭ) в комплекте с адаптером и резервуаром.
- Насос вакуумный, обеспечивающий разряжение не менее 400 мм рт. ст. и способный работать с органическими растворителями (например, мининасос-компрессор KNF модель N 86 KT 18).
- Картриджи для твердофазной экстракции strata C18-T 500мг/3мл для очистки экстрактов образцов 50 шт. в упаковке (в комплекте на 20 определений – 1 упаковка; в комплекте на 100 определений – 4 упаковки)
- Термостат колонок TSС-003 для получения воспроизводимых результатов при колебании температуры воздуха в лаборатории более чем ±3°С.
- Фильтрующая насадка на шприц Nylon 0,45 мкм диаметр 30 мм (Phenomenex) для предварительной фильтрации образца.
3. Общелабораторное оборудование
- Аналитические весы предел взвешивания 200 г, цена деления 0.1 мг с внешней калибровкой (например, весы аналитические AR2140).
- УЗ ванна объемом не менее 5 л, с таймером, и возможностью нагрева, диапазон частоты 20 – 40 кГц, суммарная полезная мощность усилителя не менее 50 Вт (например, «Сапфир»).
- Дистиллятор.
- Центрифуга со скоростью вращения ротора не менее 8000 об/мин (например ОПН-8, ротор РУ-180Л) и комплектом пластиковых пробирок.
- Комплект лабораторной посуды:
| № п/п | Описание | Коли- чество |
|---|---|---|
| 1 | Пипетки мерные лабораторные стеклянные по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29169 2-го класса точности вместимостью 10,0 см3 25,0 см3 50,0 см3 |
3 шт. 3 шт. 3 шт. |
| 2 | Колбы мерные наливные по ГОСТ 1770 2-го класса точности вместимостью 50 см3 100 см3 1000 см3 |
3 шт. 3 шт. 2 шт. |
| 3 | Цилиндр мерный по ГОСТ 1770 2-го класса точности вместимостью 50 см3 1000 см3 |
1 шт. 1 шт. |
| 4 | Колба стеклянная коническая 50 см3 | 4 шт. |
| 5 | Ёмкости из боросиликатного стекла с притёртыми пробками объёмом 50 см3 100 см3 |
2 шт. 2 шт. |
| 6 | Пробирки градуированные 10 см3 | 2 шт. |
| 7 | Шприц медицинский пластиковый двухкомпонентный одноразовый на 5 мл | 1 шт. |
| 8 | Механическое дозирующее устройство (Pumpipet) | 1 шт. |
| 9 | Пипет-дозатор переменного объема 20-200 мм3 в комплекте с наконечниками (1000 шт) | 1 шт. |
| 10 | Пипет-дозатор переменного объема 200-1000 мм3 в комплекте с наконечниками (1000 шт) | 1 шт. |
4. Комплект реактивов на 20 или 100 определений
| № п/п |
Описание | Количество на 20 определений |
Количество на 100 определений |
|---|---|---|---|
| 1 | Cтандарт-титр 0,1 N серной кислоты | 2 ампулы | 5 ампулы |
| 2 | Спирт этиловый | 0,2 кг | 1 кг |
5. Комплект стандартных образцов
| № п/п |
Описание | Количество |
|---|---|---|
| 1 | Кислота щавелевая 2-водная, х.ч. | 0,0845 г |
| 2 | Кислота лимонная 1-водная, х.ч. | 0,8791 г |
| 3 | Кислота винная по ГОСТ 5817-77, х.ч. | 0,6 г |
| 4 | Кислота яблочная по ТУ 6-09-4058-75, х.ч. | 1,0 г |
| 5 | Кислота янтарная по ГОСТ 6341-75, х.ч. | 0,5 г |
| 6 | Кислота молочная по ГОСТ 490-79, х.ч. | 0,5 г |
| Название | Колонка | Детектор |
|---|---|---|
| Органические кислоты в соке ананасовом с добавкой щавелевой кислоты | Rezex ROA-Organic Acid 300х7.8 мм 8 мкм | Спектрофотометрический |
| Стандартная смесь органических кислот | Rezex ROA-Organic Acid 300х7.8 мм 8 мкм | Спектрофотометрический |
| Органические кислоты в соке ананасовом | Rezex ROA-Organic Acid 300х7.8 мм 8 мкм | Спектрофотометрический |
| Органические кислоты в соке виноградном | Rezex ROA-Organic Acid 300х7.8 мм 8 мкм | Спектрофотометрический |
| Органические кислоты в соке яблочном | Rezex ROA-Organic Acid 300х7.8 мм 8 мкм | Спектрофотометрический |
