Методика выполнения измерений массовой концентрации органических кислот в напитках методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Свидетельство №24-08 от 04.03.2008 ФР.1.31.2008.01732

1. Объекты исследования

Настоящая методика выполнения измерений распространяется на вина виноградные, оригинальные и плодовые, напитки винные, соки и сокосодержащие напитки, виноматериалы виноградные и плодовые, сусла; и устанавливает определение массовой концентрации органических кислот (щавелевой, уксусной, лимонной, винной, яблочной, суммы молочной и янтарной) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

2. Диапазон измерений

Метод обеспечивает получение результатов измерений массовой концентрации определяемых органических кислот в пробах напитков в диапазонах, представленных в таблице 1.

Таблица 1. Диапазоны измерения массовой концентрации органических кислот в пробе напитка.

Анализируемая кислота Диапазон измерения
массовой концентрации,
мг/л
Щавелевая кислота 50-500
Лимонная кислота 100-4000
Винная кислота 500-3000
Янтарная и молочная
кислоты (сумма)
500-5000
Яблочная кислота 100-5000
Уксусная кислота 100-3000

 

3. Пробоподготовка

Отбор проб вина, винных напитков, соков и сокосодержащих напитков, виноматериалов, сусла осуществляют в стеклянные емкости, предварительно вымытые и тщательно высушенные.

Пробоподготовка проб вина, винных напитков, соков и сокосодержащих напитков, виноматериалов, сусла состоит из стадий отбора пробы, разбавления пробы водой бидистиллированной в два раза, проведения процесса твердофазной экстракции ТФЭ части разбавленной пробы (1/5 по объему) на картриджах strata C18-T.

При наличии взвешенных частиц отобранную пробу предварительно центрифугируют, супернатант (надосадочную жидкость) фильтруют с помощью одноразового шприца через фильтрующую нейлоновую насадку, очищенную пробу разбавляют водой бидистиллированной в два раза, проводят твердофазную экстракцию ТФЭ части разбавленной пробы (1/5 по объему) на картриджах strata C18-T.

Хранение проб производят в стеклянных емкостях.

Блок-схема процедуры пробоподготовки

Блок-схема

 

4. Проведение хроматографического анализа

4.1. Оборудование и условия для проведения ВЭЖХ-анализа градуировочных растворов органических кислот, подготовленной пробы воды.

Для хроматографического разделения органических кислот необходимо использовать изократическую высокоэффективную хроматографическую систему со спектрофотометрическим детектированием в УФ-области.

Для проведения анализа предварительно готовят градуировочные растворы из навесок кислот; проводят пробоподготовку; подготавливают к работе прибор.

Оборудование:

  • хроматограф жидкостный «Стайер М» с спектрофотометрическим детектором;
  • персональный компьютер с установленным программным обеспечением «МультиХром».

Условия:

  • изократический режим;
  • колонка: Rezex ROA-Organic Acid 300х7,8 мм 8 мкм (Phenomenex, США);
  • защитная колонка: Carbo-H+ 4х3,0 мм (Phenomenex, США);
  • подвижная фаза: 0,005 N раствор серной кислоты;
  • скорость потока: 0,5 мл/мин;
  • объем петли: 20 мкл;
  • детектирование: спектрофотометрическое, длина волны 210 нм

* При длине волны 254 нм детектируется пик сорбиновой кислоты, отклик пика бензойной кислоты очень слабый. Поэтому, при анализе бензойной кислоты, а также смеси сорбиновой и бензойной кислот детектирование следует проводить при длине волны 230 нм.

В рамках данной методики возможно определение таких компонентов как кофеин, аспартам, сахарин. При необходимости измерения их содержания в напитках, наряду с сорбиновой и бензойной кислотами, выбор длины волны детектирования обусловлен наличием в образце сильно окрашенных пищевых красителей.

Градуировку проводят по градуировочным растворам (во всем диапазоне определяемых концентраций) не реже 1 раза в квартал, а также при использовании новой партии реактивов, замене колонок и после ремонта хроматографа.

4.2. Определение количественного содержания органических кислот в пробе напитка.

Для определения количественного содержания компонентов пробы (органических кислот) проводят хроматографический анализ одного из градуировочных растворов и далее хроматографический анализ подготовленной пробы. Для достоверности измерений хроматографический анализ как градуировочного раствора, так и подготовленной пробы проводят не менее 2 раз подряд.

При использовании программного обеспечения «МультиХром» в отчете или над пиком (в зависимости от установок опций «ВИД») по окончании измерения автоматически определяется результат в виде концентрации определяемых кислот. Для получения результата необходимо провести два параллельных измерения (получить две хроматограммы).

За результат измерений принимают среднее арифметическое значение из двух параллельных измерений умноженное на два, т.к. в процессе пробоподготовки производилось разбавление исходной пробы в два раза.

1. Основное оборудование

Хроматограф жидкостный «Стайер М» по ТУ 4215-032-81696414-12 в составе:

2. Вспомогательное оборудование и оборудование для пробоподготовки

  • Персональный компьютер (процессор Intel Core i3 или более производительный, объём оперативной памяти не менее 8 Гб, последовательный порт или MOXA) с установленной операционной системой Windows 10, монитор, лазерный принтер.
  • Устройство для фильтрации и дегазации растворов и фильтры мембранные (фторопластовые). Предназначены для подготовки подвижной фазы в хроматографическом анализе, подключаются к водоструйному или вакуумному насосу.
  • Вакуумная установка для твердофазной экстракции (ТФЭ) в комплекте с адаптером и резервуаром.
  • Насос вакуумный, обеспечивающий разряжение не менее 400 мм рт. ст. и способный работать с органическими растворителями (например, мининасос-компрессор KNF модель N 86 KT 18).
  • Картриджи для твердофазной экстракции strata C18-T 500мг/3мл для очистки экстрактов образцов 50 шт. в упаковке (в комплекте на 20 определений – 1 упаковка; в комплекте на 100 определений – 4 упаковки)
  • Термостат колонок TSС-003 для получения воспроизводимых результатов при колебании температуры воздуха в лаборатории более чем ±3°С.
  • Фильтрующая насадка на шприц Nylon 0,45 мкм диаметр 30 мм (Phenomenex) для предварительной фильтрации образца.

3. Общелабораторное оборудование

  • Аналитические весы предел взвешивания 200 г, цена деления 0.1 мг с внешней калибровкой (например, весы аналитические AR2140).
  • УЗ ванна объемом не менее 5 л, с таймером, и возможностью нагрева, диапазон частоты 20 – 40 кГц, суммарная полезная мощность усилителя не менее 50 Вт (например, «Сапфир»).
  • Дистиллятор.
  • Центрифуга со скоростью вращения ротора не менее 8000 об/мин (например ОПН-8, ротор РУ-180Л) и комплектом пластиковых пробирок.
  • Комплект лабораторной посуды:
№ п/п Описание Коли-
чество
1 Пипетки мерные лабораторные стеклянные по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29169 2-го класса точности вместимостью
10,0 см3
25,0 см3
50,0 см3


3 шт.
3 шт.
3 шт.
2 Колбы мерные наливные по ГОСТ 1770 2-го класса точности вместимостью
50 см3
100 см3
1000 см3


3 шт.
3 шт.
2 шт.
3 Цилиндр мерный по ГОСТ 1770 2-го класса точности вместимостью
50 см3
1000 см3

1 шт.
1 шт.
4 Колба стеклянная коническая 50 см3 4 шт.
5 Ёмкости из боросиликатного стекла с притёртыми пробками объёмом
50 см3
100 см3

2 шт.
2 шт.
6 Пробирки градуированные 10 см3 2 шт.
7 Шприц медицинский пластиковый двухкомпонентный одноразовый на 5 мл 1 шт.
8 Механическое дозирующее устройство (Pumpipet) 1 шт.
9 Пипет-дозатор переменного объема 20-200 мм3 в комплекте с наконечниками (1000 шт) 1 шт.
10 Пипет-дозатор переменного объема 200-1000 мм3 в комплекте с наконечниками (1000 шт) 1 шт.

 

4. Комплект реактивов на 20 или 100 определений


п/п
Описание Количество
на 20
определений
Количество
на 100
определений
1 Cтандарт-титр 0,1 N серной кислоты 2 ампулы 5 ампулы
2 Спирт этиловый 0,2 кг 1 кг

 

5. Комплект стандартных образцов


п/п
Описание Количество
1 Кислота щавелевая 2-водная, х.ч. 0,0845 г
2 Кислота лимонная 1-водная, х.ч. 0,8791 г
3 Кислота винная по ГОСТ 5817-77, х.ч. 0,6 г
4 Кислота яблочная по ТУ 6-09-4058-75, х.ч. 1,0 г
5 Кислота янтарная по ГОСТ 6341-75, х.ч. 0,5 г
6 Кислота молочная по ГОСТ 490-79, х.ч. 0,5 г

_storage_files_methodologies_ru_0_191_10_1s.jpg

Название Колонка Детектор
Органические кислоты в соке ананасовом с добавкой щавелевой кислоты Rezex ROA-Organic Acid 300х7.8 мм 8 мкм Спектрофотометрический
Стандартная смесь органических кислот Rezex ROA-Organic Acid 300х7.8 мм 8 мкм Спектрофотометрический
Органические кислоты в соке ананасовом Rezex ROA-Organic Acid 300х7.8 мм 8 мкм Спектрофотометрический
Органические кислоты в соке виноградном Rezex ROA-Organic Acid 300х7.8 мм 8 мкм Спектрофотометрический
Органические кислоты в соке яблочном Rezex ROA-Organic Acid 300х7.8 мм 8 мкм Спектрофотометрический
Миниатюра схемы