Методика выполнения измерений массовой концентрации афлатоксина М1 в молоке, молочных продуктах и масле коровьем методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Свидетельство №48-08 от 26.03.2008 ФР.1.31.2008.01731

1. Объекты исследования

Настоящая методика выполнения измерений распространяется на молоко, молочные продукты и коровье масло и устанавливает определение массовой концентрации афлатоксина М1 методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуориметрическим детектированием.

2. Диапазон измерений

Метод обеспечивает получение результатов измерений массовой концентрации афлфтоксина М1 в пробах молока, молочных продуктов и коровьем масле на уровне не менее половины ПДК (0,00025 мг/кг).

ПДК М1 в молоке и продуктах его переработки регламентируется СанПин 1078-01 на уровне 0,0005 мг/кг.

3. Пробоподготовка

Отбор проб производят в чистые тщательно высушенные стеклянные емкости. Пробу взвешивают на аналитических весах (результат взвешивания записывают до четвертого десятичного знака).

Пробу сыра необходимо предварительно мелко измельчить, пробу масла – растопить. Для измельчения можно использовать мелкую кухонную терку.

Навеску сухого молока необходимо предварительно растворить в дистиллированной воде (10 г в 10 мл), подогретой до температуры 40 °С.

Пробоподготовка состоит из этапов отбора пробы; осаждения белка путем первичной экстракции афлатоксина М1 раствором натрия хлористого и лимонной кислоты при подогреве до 30–35°С и последующей экстракции хлороформом (предварительно подогретом до 30–35°С) в конической колбе; центрифугирования; переноса содержимого пробирок (без белкового осадка) в делительную воронку, дополнительной промывки белковых осадков хлороформом и переносе хлороформных слоев в делительную воронку, разделения слоев объединенных супернатантов в делительной воронке, упаривания отделенного хлороформного слоя на роторном испарителе, добавления точных объемов воды дистиллированной и гексана, разделения водного и гексанового слоев в делительной воронке, отделения водного слоя, повторного добавления к водному слою гексана, разделения слоев в делительной воронке; последующей очистки и концентрирования водного слоя (обезжиренного водного экстракта) с добавкой 5% ацетонитрила методом твердофазной экстракции на картриджах Strata C18-E, элюирования, отдувки элюента до заданного объема при температуре не выше 50°С.

Пробы хранят в холодильнике при температуре 4 – 6 °С.

Блок-схема процедуры пробоподготовки

Блок-схема процедуры пробоподготовки

 

4. Проведение хроматографического анализа

4.1. Оборудование и условия для проведения ВЭЖХ-анализа градуировочных растворов афлатоксина М1, подготовленной пробы продукта.

Для хроматографического анализа афлатоксина М1 необходимо использовать изократическую высокоэффективную жидкостную хроматографическую систему с флуориметрическим детекторованием.

Для проведения анализа предварительно готовят градуировочные растворы из СО афлатоксина М1 в ацетонитриле или из СО афлатоксина М1 в смеси бензола с ацетонитрилом (растворитель отдувают и перерастворяют стандартный образец в чистом ацетонитриле); проводят пробоподготовку; подготавливают к работе прибор.

Оборудование:

  • хроматограф жидкостный «Стайер М» с флуориметрическим детектором;
  • персональный компьютер с установленным программным обеспечением «МультиХром».

Условия:

  • изократический режим;
  • колонка: Synergi Polar-RP 250х4,6 мм 4 мкм (Phenomenex, США);
  • защитная колонка: Polar-RP 4x3,0 мм (Phenomenex, США);
  • подвижная фаза: раствор ацетонитрил/вода (2:3);
  • скорость потока: 0,8 мл/мин;
  • объем петли: 20 мкл;
  • температура: 20°С;
  • диапазон RFU: 0,005;
  • детектирование: флуориметрическое (λex: 365±2 нм; λem: 400-460 нм).

Градуировку проводят по градуировочным растворам (во всем диапазоне определяемых концентраций) не реже 1 раза в месяц, а также при использовании новой партии реактивов, замене колонок и после ремонта хроматографа.

4.2. Определение количественного содержания афлатоксина М1 в пробе продукта

Для определения количественного содержания компонента пробы продукта (афлатоксина М1) проводят хроматографический анализ одного из градуировочных растворов и далее хроматографический анализ подготовленной пробы. Для достоверности измерений хроматографический анализ как градуировочного раствора, так и подготовленной пробы проводят не менее 2 раз подряд.

При использовании программного обеспечения «МультиХром» в отчете или над пиком (в зависимости от установок опций «ВИД») по окончании измерения автоматически определяется результат в виде концентрации в пробе, введенной в хроматограф (но не в исходном образце, взятом для исследования!).

Для получения результата необходимо провести как минимум два параллельных измерения (получить две хроматограммы). За результат измерений принимают среднее арифметическое значение содержания афлатоксина М1 в концентрате анализируемой пробы, мкг/л.

Массовую концентрацию афлатоксина М1 в анализируемой пробе, мкг/л (в исходном образце) Х, мкг/кг рассчитывают по формуле:

где:
Схр – среднее значение концентрации афлатоксина М1, полученное в результате хроматографирования в двух параллельных измерениях [мкг/л];
V1 – объем элюата после проведения ТФЭ и концентрирования, часть из которого вводится в хроматограф (около 2 мл) [мл];
Kпр – коэффициент пробоподготовки в целом, равный 0,85;
mпр – масса пробы продукта, взятого на анализ (см. таблицу 1) [г].

Таблица 1. Массы навесок образцов и объемы первичного раствора для экстракции.

Наименование
образца
Навеска, г Объем добавляемого
раствора для первичной
экстракции (1), мл
молоко 20 10
кефир 20 10
сметана 10 10
творог 10 15
масло 10 15
сыр 10 15
молоко сухое 10 40

1. Основное оборудование

Хроматограф жидкостный «Стайер М» по ТУ 4215-032-81696414-12 в составе:

2. Вспомогательное оборудование и оборудование для пробоподготовки

  • Персональный компьютер (процессор Intel Core i3 или более производительный, объём оперативной памяти не менее 8 Гб, последовательный порт или MOXA) с установленной операционной системой Windows 10, монитор, лазерный принтер.
  • Устройство для фильтрации и дегазации растворов и фильтры мембранные (тефлоновые, PTFE). Предназначены для подготовки подвижной фазы в хроматографическом анализе, подключаются к водоструйному или вакуумному насосу.
  • Термостат колонок TSС-003 для получения воспроизводимых результатов при колебании температуры воздуха в лаборатории более чем ±3°С.
  • Фильтрующая насадка на шприц для предварительной фильтрации образца.
  • Вакуумная установка для твердофазной экстракции (ТФЭ) в комплекте с адаптером и резервуаром.
  • Насос вакуумный, обеспечивающий разряжение не менее 400 мм рт. ст. и способный работать с органическими растворителями (например, мининасос-компрессор KNF модель N 86 KT 18).
  • Картриджи для твердофазной экстракции strata C18-E 500мг/3мл для очистки экстрактов образцов, 50 шт. в упаковке (в комплекте на 20 определений – 1 упаковка; в комплекте на 100 определений – 4 упаковки).

3. Общелабораторное оборудование

  • Аналитические весы предел взвешивания 200 г, цена деления 0.1 мг с внешней калибровкой (например, весы аналитические AR2140).
  • Центрифуга со скоростью вращения ротора не менее 8000 об/мин (например, ОПН-8, ротор РУ-180Л).
  • УЗ ванна объемом не менее 5 л, с таймером, и возможностью нагрева, диапазон частоты 20 – 40 кГц, суммарная полезная мощность усилителя не менее 50 Вт (например, «Сапфир»).
  • Дистиллятор.
  • Устройство для отдувки образцов в токе воздуха (испарительный концентратор) и ротационный испаритель.
  • Компрессор безмасляный производительность от 100 л/ч.
  • Шкаф вытяжной (необходим для работы с хлороформом).
  • Комплект лабораторной посуды:
№ п/п Описание Коли-
чество
1 Пипетки мерные лабораторные стеклянные по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29169 2-го класса точности вместимостью
1,0 см3
2,0 см3
5,0 см3
10,0 см3


5 шт.
5 шт.
5 шт.
5 шт.
2 Микропипетка мерная градуированная лабораторная концевая стеклянная вместимостью 5,0 мл 1 шт.
3 Колбы мерные наливные по ГОСТ 1770 2-го класса точности вместимостью
10 см3
100 см3
500 см3

5 шт.
5 шт.
1 шт.
4 Колба грушевидная ГР-10-14/23 со шлифом вместимостью 100 см3 1 шт.
5 Воронка делительная конусная ВД-3-100 19/26 с пробкой 19/26 2 шт.
6 Пробка ПМ1 КШ 14/23 1 шт.
7 Воронка стеклянная лабораторная В-36-50 1 шт.
8 Цилиндр мерный по ГОСТ 1770 2-го класса точности вместимостью
25 см3
50 см3
100 см3
500 см3

3 шт.
3 шт.
2 шт.
1 шт.
9 Пробирка мерная стеклянная градуированная с узким дном по ГОСТ 1770 2-го класса точности вместимостью 10 см3 1 шт.
10 Колба стеклянная коническая КН-1-250-29/32 со шлифом на 250 мл 1 шт.
11 Стеклянная емкость для подвижной фазы объемом 500 см3 1 шт.
12 Емкости (виалы) из темного стекла с герметично закрывающимися крышками 10 мл 1 шт.
13 Палочка стеклянная 1 шт.
14 Пробка полиэтиленовая № 29/32 1 шт.
15 Шприц медицинский пластиковый двухкомпонентный одноразовый на 5 мл 2 шт.
16 Механическое дозирующее устройство (Pumpipet) 1 шт.
17 Пипет-дозатор переменного объема 20-200 мм3 в комплекте с наконечниками (1000 шт) 1 шт.
18 Пипет-дозатор переменного объема 200-1000 мм3 в комплекте с наконечниками (1000 шт) 1 шт.

 

4. Комплект реактивов на 20 или 100 определений


п/п
Описание Количество
на 20
определений
Количество
на 100
определений
1 Ацетонитрил УФ 210, х.ч. 1,5 кг 6 кг
2 Хлороформ, х.ч. 3 кг 13 кг
3 Кислота уксусная ледяная, ч.д.а. 50 мл
(мин. фасовка)
250 мл
4 Кислота лимонная моногидрат, х.ч. 40 мг
(мин. фасовка)
180 мг
(мин. фасовка)
5 н-Гексан, х.ч. 1 кг 3 кг
6 Натрий сернокислый безводный 25 г
(мин. фасовка)
120 г
(мин. фасовка)
7 Натрий хлористый, х.ч. 240 г
(мин. фасовка)
1200 г
(мин. фасовка)
8 Аммиак водный, о.с.ч. 20 г
(мин. фасовка)
100 г
(мин. фасовка)
9 Натрий углекислый 3 г
(мин. фасовка)
13 г
(мин. фасовка)
10 Бензол, х.ч. 1 кг 1 кг

 

5. Комплект стандартных образцов


п/п
Описание Количество
1 Стандарт афлатоксина M1 1 ампула

_storage_files_methodologies_ru_0_204_16_1s.jpg

Название Колонка Детектор
Афлатоксин М1 в пробе молока Synergi Polar-RP 250х4.6 мм 4 мкм Флуориметрический
Афлатоксин М1 в пробе сливок Synergi Polar-RP 250х4.6 мм 4 мкм Флуориметрический
Афлатоксин М1 в пробе сметаны Synergi Polar-RP 250х4.6 мм 4 мкм Флуориметрический
Стандартный раствор афлатоксина М1 Synergi Polar-RP 250х4.6 мм 4 мкм Флуориметрический
Афлатоксин М1 в пробе масла сливочного Synergi Polar-RP 250х4.6 мм 4 мкм Флуориметрический
Афлатоксин М1 в пробе сыра Synergi Polar-RP 250х4.6 мм 4 мкм Флуориметрический
Миниатюра схемы