Методика выполнения измерений массовой доли зеараленона в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Свидетельство №32-08 от 04.03.2008 ФР.1.31.2008.04630

1. Объекты исследования

Настоящая методика выполнения измерений распространяется на муку пшеничную, в т.ч. макаронные изделия, ржаную, тритикалевую, кукурузную, ячменную, просяную (пшенную), рисовую, гречневую, сорговую; бараночные, сухарные изделия; хлеб и хлебобулочные изделия (булки); кондитерские изделия (пирожные, торты); сою, пряности, орехи, семечки; ячменную муку, крупу, хлопья; и устанавливает метод определения массовой концентрации зеараленона при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием спектрофотометрического определения.

2. Диапазон измерений

Значение ПДК для зеараленона в муке пшеничной, в т.ч. макаронных изделиях, ржаной, тритикалевой, кукурузной, просяной (пшенной), рисовой, гречневой, сорговой, ячменной, крупе ячменной, ячменных хлопьях, орехах, кондитерских изделиях (торты, пирожные), бараночных, сухарных изделиях, хлебе и хлебобулочных изделиях (булках), согласно СанПиН 2.3.2.1078-01 (п. 1.4.4.), составляет 0,2 мг/кг (200 мкг/кг).

Данная методика позволяет определять содержание зеараленона в продуктах питания в концентрациях от 0,1 до 0,8 мг/кг (100 – 800 мкг/кг).

3. Пробоподготовка

Для анализа зеараленона используют свободные от посторонних примесей и продуктов жизнедеятельности животных и микроорганизмов (плесени) пробы.

Твердые изделия (макароны, сушки, сухари) предварительно измельчают в блендере до состояния гомогенной массы.

Орехи, кондитерские изделия (торты, пирожные), хлеб и хлебобулочные изделия (булки) для обеспечения однородности пробы и удаления избыточной влаги смешивают с натрием сернокислым в соотношении 1:3 (по массе) и измельчают в блендере до состояния гомогенной массы.

Пробы муки (различных сортов) и пряностей в виде порошка (перец, корица) не требуют предварительного измельчения.

Пробу продукта (измельченную, гомогенизированную) экстрагируют этилацетатом в колбе с полиэтиленовой пробкой, используя УЗ-ванну; колбу оставляют при комнатной температуре на 20 мин для осаждения осадка, верхний слой (супернатант) декантируют и фильтруют через пробку из фильтровальной бумаги и фильтрующую насадку PTFE с помощью одноразового пластикового шприца в мерный стеклянный цилиндр, фильтрат отдувают до заданного объема, приливают гексан и перемешивают содержимое цилиндра при помощи УЗ-ванны. Полученный раствор подвергают очистке с помощью твердофазной экстракции на картриджах Strata NH2, собранный элюат оставляют при комнатной температуре на время не менее, чем 10 мин.

Блок-схема процедуры пробоподготовки

Блок-схема

 

Таблица 1. Объемы этилацетата (V1), необходимые для первичной жидкостной экстракции зеараленона из различных продуктов

Продукт Мука, пряности, твердые изделия (макароны, сушки, сухари) Орехи, семечки Кондитерские изделия (торты, пирожные) с содержанием жира более 10% Хлеб и хлебобулочные изделия
количество этилацетата, V1 [мл] 50 50 50 75

 

4. Проведение хроматографического анализа

4.1. Оборудование и условия для проведения ВЭЖХ-анализа градуировочных растворов зеараленона, подготовленной пробы продукта.

Для хроматографического определения зеараленона необходимо использовать изократическую высокоэффективную жидкостную хроматографическую систему со спектрофотометрическим детектированием.

Для проведения анализа предварительно готовят градуировочные растворы из СОП зеараленона в ацетонитриле или из СОП зеараленона в смеси бензол – ацетонитрил (98:2); проводят пробоподготовку; подготавливают к работе прибор.

Оборудование:

  • хроматограф жидкостный «Стайер М» с спектрофотометрическим детектором;
  • персональный компьютер с установленным программным обеспечением «МультиХром».

Условия:

  • изократический режим;
  • колонка: Synergi Hydro-RP 4 мкм 250х4,6 мм или Synergi Hydro-RP 4 мкм 250x3,0 мм (Phenomenex, США);
  • защитная колонка: С18 4x3,0 мм (Phenomenex, США);
  • подвижная фаза: смесь ацетонитрил – вода – концентрированная ортофосфорная кислота (60:40:1);
  • скорость потока: 0,9 мл/мин (или 0,4 мл/мин при использовании колонок Synergi Hydro-RP 250х3,0 мм);
  • объем петли: 20 мкл;
  • температура: 50°С;
  • детектирование: спектрофотометрическое, длина волны 280 нм.

Градуировку во всем диапазоне измеряемых концентраций проводят не реже 1 раза в 2 недели, а также при использовании новой партии реактивов, замене колонок и после ремонта хроматографа.

4.2. Определение количественного содержания зеараленона в пробе продукта

Для определения количественного содержания компонента пробы (зеараленона) проводят хроматографический анализ одного из градуировочных растворов и далее хроматографический анализ подготовленной пробы. Для достоверности измерений хроматографический анализ как градуировочного раствора, так и подготовленной пробы проводят не менее 2 раз подряд.

При использовании программного обеспечения «МультиХром» в отчете или над пиком (в зависимости от установок опций «ВИД») по окончании измерения автоматически определяется результат в виде концентрации в пробе, введенной в хроматограф (но не в исходном образце, взятом для исследования!).

Для получения результата необходимо провести как минимум два параллельных измерения (получить две хроматограммы). За результат измерений принимают среднее арифметическое значение зеараленона в концентрате анализируемой пробы Cхр, мкг/л.

Массовую концентрацию зеараленона в анализируемой пробе (в исходном образце) Х, мкг/кг рассчитывают по формуле:


где:
Схр – среднее значение концентрации зеараленона, полученное в результате хроматографирования в двух параллельных измерениях [нг/мл];
V1 – объем исходного экстракта, фактически равный объему этилацетата, взятого для первичной экстракции (50 или 75 мл, см. табл. 1) [мл];
V2 – объем отфильтрованного экстракта (фильтрата), взятого для дальнейшей обработки, (25 мл) [мл];
V3 – объем элюата после проведения ТФЭ, часть из которого вводится в хроматограф (около 1,5 мл) [мл];
Kэкстр.1 – коэффициент первичной жидкостной экстракции этилацетатом;
KТФЭэкстр.2 – коэффициент твердофазной экстракции зеараленона;
mпр. – масса пробы продукта, взятого на анализ [г].

1. Основное оборудование

Хроматограф жидкостный «Стайер М» по ТУ 4215-032-81696414-12 в составе:

2. Вспомогательное оборудование и оборудование для пробоподготовки

  • Персональный компьютер (процессор Intel Core i3 или более производительный, объём оперативной памяти не менее 8 Гб, последовательный порт или MOXA) с установленной операционной системой Windows 10, монитор, лазерный принтер.
  • Устройство для фильтрации и дегазации растворов и фильтры мембранные (тефлоновые, PTFE). Предназначены для подготовки подвижной фазы в хроматографическом анализе, подключаются к водоструйному или вакуумному насосу.
  • Вакуумная установка для твердофазной экстракции (ТФЭ) в комплекте с адаптером и резервуаром.
  • Насос вакуумный, обеспечивающий разряжение не менее 400 мм рт. ст. и способный работать с органическими растворителями (например, мининасос-компрессор KNF модель N 86 KT 18).
  • Картриджи для твердофазной экстракции strata NH2 500мг/3мл для очистки экстрактов образцов 50 шт. в упаковке (в комплекте на 20 определений – 1 упаковка; в комплекте на 100 определений – 4 упаковки).
  • Фильтрующая насадка на шприц для предварительной фильтрации экстракта образца, тефлон 0.45 мкм, диаметр 30 мм.
  • Измельчитель (блендер) 22000 об/мин с объемом стакана 250 мл (например, Waring)

3. Общелабораторное оборудование

  • Аналитические весы предел взвешивания 200 г, цена деления 0.1 мг с внешней калибровкой (например, весы аналитические AR2140).
  • УЗ ванна объемом не менее 5 л, с таймером, и возможностью нагрева, диапазон частоты 20 – 40 кГц, суммарная полезная мощность усилителя не менее 50 Вт (например, «Сапфир»).
  • Дистиллятор.
  • Устройство для отдувки образцов в токе воздуха (испарительный концентратор).
  • Компрессор безмаслянный производительность от 100 л/ч.
  • Комплект лабораторной посуды:
№ п/п Описание Коли-
чество
1 Пипетки мерные лабораторные стеклянные по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29169 2-го класса точности вместимостью
1,0 см3
2,0 см3
5,0 см3
10,0 см3


3 шт.
3 шт.
3 шт.
3 шт.
2 Пипетка мерная градуированная лабораторная концевая стеклянная вместимостью 2,0 см3 1 шт.
3 Колбы мерные наливные по ГОСТ 1770 2-го класса точности вместимостью
10 см3
50 см3

4 шт.
1 шт.
4 Цилиндр мерный по ГОСТ 1770 2-го класса точности вместимостью
25 см3 (с пластмассовым дном-подставкой)
50 см3 (с пластмассовым дном-подставкой)
100 см3
500 см3

2 шт.
2 шт.
2 шт.
1 шт.
5 Стакан лабораторный стеклянный В-1-800 вместимостью 800 мл 1 шт.
6 Стакан лабораторный стеклянный ВН-100 вместимостью 100 мл 1 шт.
7 Пробирка мерная стеклянная градуированная с узким дном по ГОСТ 1770 2-го класса точности вместимостью 10 см3 4 шт.
8 Колба стеклянная коническая 29/32 со шлифом вместимостью
100 см3
250 см3

1 шт.
1 шт.
9 Колба стеклянная коническая 14/23 со шлифом вместимостью 25 см3 1 шт.
10 Пробка полиэтиленовая 29/32 1 шт.
11 Пробка стеклянная со шлифом 29/32 1 шт.
12 Пробка стеклянная со шлифом 14/23 1 шт.
13 Стеклянная емкость для подвижной фазы объемом 1000 см3 1 шт.
14 Емкости (виалы) из темного стекла с герметично закрывающимися крышками объёмом 10 см3 3 шт.
15 Палочка стеклянная 1 шт.
16 Шприц медицинский пластиковый двухкомпонентный одноразовый
на 20 см3
1 шт.
17 Механическое дозирующее устройство (Pumpipet) 1 шт.
18 Пипет-дозатор переменного объема 200-1000 мм3 в комплекте с наконечниками (1000 шт) 1 шт.

 

4. Комплект реактивов на 20 или 100 определений


п/п
Описание Количество
на 20
определений
Количество
на 100
определений
1 Ацетонитрил УФ 210, х.ч. 1 кг 4 кг
2 Тетрагидрофуран, х.ч. * 1 кг 1 кг
3 Этилацетат, х.ч. 2,5 кг 12,5 кг
4 н-Гексан, х.ч. 1 кг 4 кг
5 Натрий сернокислый безводный, х.ч. 2,5 кг 8 кг
6 Фосфорная кислота, х.ч. 10 г (мин. фасовка) 45 г (мин. фасовка)

* Применяется не чаще чем 1 раз на 20 проб для отмывки колонки (в случае необходимости).

5. Комплект стандартных образцов


п/п
Описание Количество
1 Стандарт зеараленона (СОП 0025-97*) с содержанием зеараленона
100 мкг/см3
1 ампула

_storage_files_methodologies_ru_0_198_14_1s.jpg

Название Колонка Детектор
Зеараленон в пробе хлеба Synergi Hydro-RP 250х4.6 мм 4 мкм Спектрофотометрический
Стандартный раствор зеараленона Synergi Hydro-RP 250х4.6 мм 4 мкм Спектрофотометрический
Миниатюра схемы