Методика выполнения измерений массовой доли витаминов A, E и D3 в пищевых продуктах, продовольственном сырье, комбикормах, премиксах, БАД и витаминных концентратах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

1. Объекты исследования

Настоящая методика устанавливает метод измерения массовой доли жирорастворимых витаминов A (ретинола и его сложноэфирных форм), Е (α-токоферола и его сложноэфирных форм) и D₃ (холекальциферола) в пищевых продуктах (в том числе, в детском питании), продовольственном сырье, комбикормах, премиксах, БАД и витаминных концентратах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

2. Диапазон измерений

Диапазоны измерений массовой доли витаминов представлены в таблице.

3. Пробоподготовка

Подготовка проб к измерениям включает следующие этапы:

• щелочной гидролиз пробы продукта и извлечение из пробы витаминов;
• очистка гидролизата и концентрирование витаминов из пробы методом твердофазной экстракции;
• подготовка пробы для ввода в хроматограф.

Для анализа готовят две параллельные пробы.

Блок-схема процедуры пробоподготовки

4. Проведение хроматографического анализа

4.1. Оборудование и условия для проведения ВЭЖХ-анализа градуировочных растворов витаминов A, E и D₃ и подготовленной пробы

Для хроматографического определения жирорастворимых витаминов A, E и D₃ необходимо использовать градиентную ВЭЖХ-систему с спектрофотометрическим детектором, позволяющим изменение длины волны источника света в процессе анализа, и термостатом колонок.

Для проведения анализа предварительно готовят градуировочные растворы  A, E и D₃; проводят пробоподготовку; подготавливают к работе прибор.

Оборудование:

• хроматограф жидкостный «Стайер М» с спектрофотометрическим детектором;
• термостат колонок;
• персональный компьютер с установленным программным обеспечением «МультиХром».

Условия:

• градиентный режим разделения;
• подвижная фаза: ацетонитрил (элюент А) – дихлорметан (элюент В);
• программа градиентного элюирования:
  • начало A=100% B=0%;
  • градиент A=90% B=10% за 8 мин;
  • градиент A=70% B=30% за 2 мин;
  • изократика A=70% B=30% 10 мин;
  • градиент A=100% B=0% за 3 мин;
  • изократика A=100% B=0%
• колонка: «Luna C18(2)» 5 мкм 250х4,6 мм (Phenomenex, США);
• защитная колонка: «С18» 4x3,0 мм (Phenomenex, США);
• скорость потока: 1,0 см³/мин;
• объем петлевого дозатора: 20 мкл;
• температура: комнатная;
• детектирование: спектрофотометрическое при смене длины волны источника света во время анализа
  • 0 мин - длина волны 436 нм,
  • 10 мин - длина волны 280 нм,
  • 27 мин - длина волны 436 нм.

Градуировку во всем диапазоне измеряемых концентраций проводят не реже 1 раза в месяц, а также при смене колонки и/или защитной колонки, при замене веществ и/или реактивов; после проведения ремонта хроматографа, после длительного простоя хроматографа (2 недели и более), при изменении эффективности хроматографической системы и/или чувствительности детектора.

4.2. Определение количественного содержания витаминов A, E и D₃ в пробе

Для получения результата измерений проводят анализ двух параллельных проб, для каждой из которых выполняют по два измерения (получают по две хроматограммы). Массовая концентрация анализируемой i-го компонента (витамина А (ретинола), витамина Е (α-токоферола) и витамина D₃ (холекальциферола)) в параллельных пробах, введенных в хроматограф (C_i1) и (C_i2), автоматически рассчитывается системой сбора и обработки хроматографической информации.

Если массовая концентрация пробы, введенной в хроматограф, оказывается больше верхней границы диапазона градуировки (для витамина А – 0,0200 мг/дм³, для витамина Е – 0,1500 г/дм³, для витамина D₃ – 0,0150 г/дм³), пробу перед вводом в хроматограф разбавляют спиртом изопропиловым. Коэффициент разбавления учитывают при расчете.

Рассчитывают среднее арифметическое значение массовой концентрации i-го компонента  в пробах, введенных в хроматограф (C_i1 и C_i2), по результатам двух измерений для каждой из параллельных проб по формуле

С_iср  = ( С_i1 + С_i2 ) / 2

Массовую долю i-го компонента  в анализируемой пробе X_{i пр}, [мг/кг] рассчитывают по формуле:

где:
С_iср – среднее значение массовой концентрации i-го компонента в пробе, введенной в хроматограф [г/дм³];
m_пр – масса пробы продукта, [г];
V₁ – объём гидролизата [см³];
V₂ – объём гидролизата, взятого на анализ, до разбавления водой (V₂ = 8 см³);
V₃ – объём элюата;
K₁ – коэффициент, учитывающей выход реакции гидролиза и степень извлечения витаминов из пробы (см. таблицу);
K₂ – коэффициент различия процедур подготовки к анализу градуировочных растворов и проб, рассчитанный по формуле

где:
V_гр1 – объем гидролизата градуировочных растворов [см³];
V_гр3 – объем элюата при ТФЭ градуировочных растворов.

После сокращений расчётная формула принимает вид:

Коэффициент K₁, учитывающий выход реакции гидролиза и степень извлечения витаминов из пробы для различных видов продуктов (эмпирические данные):

За результат измерений принимают среднее арифметическое значение массовой доли i-го компонента  в двух параллельных пробах.