Методика выполнения измерений массовой доли витаминов A, E и D3 в пищевых продуктах, продовольственном сырье, комбикормах, премиксах, БАД и витаминных концентратах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Свидетельство №43-08 от 20.03.2008 ФР.1.31.2008.04634

1. Объекты исследования

Настоящая методика устанавливает метод измерения массовой доли жирорастворимых витаминов A (ретинола и его сложноэфирных форм), Е (α-токоферола и его сложноэфирных форм) и D3 (холекальциферола) в пищевых продуктах (в том числе, в детском питании), продовольственном сырье, комбикормах, премиксах, БАД и витаминных концентратах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

2. Диапазон измерений

Диапазоны измерений массовой доли витаминов представлены в таблице.

Наименование
объекта
Диапазон
измерений
массовой
доли,
мг/кг
Показатель
точности
(границы
относительной
погрешности),
 ±δ, %,
при Р=0,95
Показатель
повторяемости
(относительное
среднеквадрати-
ческое отклонение
повторяемости),
σr, %
Показатель
воспроизводимости
(относительное
среднеквадрати-
ческое отклонение
воспроизводимости),
σR , %
Предел
повторяемости,
 r, %,
P=0,95, n=2
Витамин А от 0,2 до 9,0 вкл. 20 6 9 17
св. 9,0 до 50,0 вкл. 17 5 8 14
св. 50,0 до 5000 вкл. 14 3,5 6 10
Витамин Е от 25,0 до 240,0 вкл. 32 10 15 28
св. 240,0 до1500 вкл. 20 5 8 14
Витамин D3 от 0,5 до 50,0 вкл. 28 9 14 25
св. 50,0 до 100 вкл. 14 4,5 7 12

 

3. Пробоподготовка

Подготовка проб к измерениям включает следующие этапы:

  • щелочной гидролиз пробы продукта и извлечение из пробы витаминов;
  • очистка гидролизата и концентрирование витаминов из пробы методом твердофазной экстракции;
  • подготовка пробы для ввода в хроматограф.

Для анализа готовят две параллельные пробы.

Блок-схема процедуры пробоподготовки

Блок-схема процедуры пробоподготовки

4. Проведение хроматографического анализа

4.1. Оборудование и условия для проведения ВЭЖХ-анализа градуировочных растворов витаминов A, E и D3 и подготовленной пробы

Для хроматографического определения жирорастворимых витаминов A, E и D3 необходимо использовать градиентную ВЭЖХ-систему с спектрофотометрическим детектором, позволяющим изменение длины волны источника света в процессе анализа, и термостатом колонок.

Для проведения анализа предварительно готовят градуировочные растворы  A, E и D3; проводят пробоподготовку; подготавливают к работе прибор.

Оборудование:

  • хроматограф жидкостный «Стайер М» с спектрофотометрическим детектором;
  • термостат колонок;
  • персональный компьютер с установленным программным обеспечением «МультиХром».

Условия:

  • градиентный режим разделения;
  • подвижная фаза: ацетонитрил (элюент А) – дихлорметан (элюент В);
  • программа градиентного элюирования:
    • начало A=100% B=0%;
    • градиент A=90% B=10% за 8 мин;
    • градиент A=70% B=30% за 2 мин;
    • изократика A=70% B=30% 10 мин;
    • градиент A=100% B=0% за 3 мин;
    • изократика A=100% B=0%
  • колонка: «Luna C18(2)» 5 мкм 250х4,6 мм (Phenomenex, США);
  • защитная колонка: «С18» 4x3,0 мм (Phenomenex, США);
  • скорость потока: 1,0 см3/мин;
  • объем петлевого дозатора: 20 мкл;
  • температура: комнатная;
  • детектирование: спектрофотометрическое при смене длины волны источника света во время анализа
    • 0 мин - длина волны 436 нм,
    • 10 мин - длина волны 280 нм,
    • 27 мин - длина волны 436 нм.

Градуировку во всем диапазоне измеряемых концентраций проводят не реже 1 раза в месяц, а также при смене колонки и/или защитной колонки, при замене веществ и/или реактивов; после проведения ремонта хроматографа, после длительного простоя хроматографа (2 недели и более), при изменении эффективности хроматографической системы и/или чувствительности детектора.

4.2. Определение количественного содержания витаминов A, E и D3 в пробе

Для получения результата измерений проводят анализ двух параллельных проб, для каждой из которых выполняют по два измерения (получают по две хроматограммы). Массовая концентрация анализируемой i-го компонента (витамина А (ретинола), витамина Е (α-токоферола) и витамина D3 (холекальциферола)) в параллельных пробах, введенных в хроматограф (Ci1) и (Ci2), автоматически рассчитывается системой сбора и обработки хроматографической информации.

Если массовая концентрация пробы, введенной в хроматограф, оказывается больше верхней границы диапазона градуировки (для витамина А – 0,0200 мг/дм3, для витамина Е – 0,1500 г/дм3, для витамина D3 – 0,0150 г/дм3), пробу перед вводом в хроматограф разбавляют спиртом изопропиловым. Коэффициент разбавления учитывают при расчете.

Рассчитывают среднее арифметическое значение массовой концентрации i-го компонента  в пробах, введенных в хроматограф (Ci1 и Ci2), по результатам двух измерений для каждой из параллельных проб по формуле

Сiср  = ( Сi1 + Сi2 ) / 2

Массовую долю i-го компонента  в анализируемой пробе Xi пр, [мг/кг] рассчитывают по формуле:


где:
Сiср – среднее значение массовой концентрации i-го компонента в пробе, введенной в хроматограф [г/дм3];
mпр – масса пробы продукта, [г];
V1 – объём гидролизата [см3];
V2 – объём гидролизата, взятого на анализ, до разбавления водой (V2 = 8 см3);
V3 – объём элюата;
K1 – коэффициент, учитывающей выход реакции гидролиза и степень извлечения витаминов из пробы (см. таблицу);
K2 – коэффициент различия процедур подготовки к анализу градуировочных растворов и проб, рассчитанный по формуле

где:
Vгр1
– объем гидролизата градуировочных растворов [см3];
Vгр3 – объем элюата при ТФЭ градуировочных растворов.

После сокращений расчётная формула принимает вид:

Коэффициент K1, учитывающий выход реакции гидролиза и степень извлечения витаминов из пробы для различных видов продуктов (эмпирические данные):

Коэффициент
K1
Мука, хлеб,
макаронные
изделия
Премиксы, БАД,
витаминные
препараты
Масложировая
продукция
Витамин А 0,90 0.98 0,90
Витамин Е 0,70 0,98 0,65
Витамин D3 0,90 0,98 0,80

За результат измерений принимают среднее арифметическое значение массовой доли i-го компонента  в двух параллельных пробах.

1. Основное оборудование

Хроматограф жидкостный «Стайер М» по ТУ 4215-032-81696414-12 в составе:

2. Вспомогательное оборудование и оборудование для пробоподготовки

  • Персональный компьютер (процессор Intel Core i3 или более производительный, объём оперативной памяти не менее 8 Гб, последовательный порт или MOXA) с установленной операционной системой Windows 10, монитор, лазерный принтер.
  • Насос вакуумный, производительность – 5,5 дм3/мин, разряжение – 160 мбар, или насос, обеспечивающий разряжение не менее 400 мм рт. ст., способный работать с органическими растворителями.
  • Вакуумная установка для твердофазной экстракции (ТФЭ) в комплекте с адаптером и резервуаром.
  • Картриджи для твердофазной экстракции Strata C18-E 500мг/6мл (Phenomenex).

3. Общелабораторное оборудование

  • Весы лабораторные электронные с наибольшим пределом взвешивания 200 г, класс точности "специальный" по ГОСТ 24104-2001.
  • Ванна ультразвуковая, диапазон частоты 20-40 кГц, мощность не менее 50 Вт.
  • Мешалка магнитная с подогревом RT 10 power (IKA, Германия), 10 позиций, диапазон скорости вращения 0–1100 об/мин, температура на поверхности нагревателя не более (110±2) °C с комплектом тефлонированных магнитных мешальников.
  • Измельчитель (блендер), 22000 об/мин, объем стакана 250 см3 (для измельчения пробы продукта).
  • Центрифуга «ОПН-8» со скоростью вращения ротора не менее 8000 об/мин и пластиковыми пробирками объемом не менее 25 см3.
  • Аквадистиллятор по ГОСТ 28165-89.
  • Шкаф суховоздушный лабораторный ШСвЛ-80 «Касимов».
  • Пипетки лабораторные стеклянные градуированные, 2 класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 см3 по ГОСТ 29227-91.
  • Пипетки лабораторные стеклянные концевые градуированные, 2 класса точности вместимостью 2 см3 по ГОСТ 29227-91.
  • Посуда мерная лабораторная стеклянная 2 класса точности по ГОСТ 1770-74:
    • колбы мерные наливные вместимостью 10, 25, 100 и 250 см3;
    • цилиндры вместимостью 25 и 50 см3;
    • пробирки с узким дном вместимостью 10 см3.
  • Колбы конические КН-1-10-14/23, КН-1-50-14/23 и КН-1-100-29/32 по ТУ 92-891.029.
  • Склянки из темного стекла с герметично закрывающимися крышками, вместимостью 250 см3 по ГОСТ 25336-82.
  • Пробки полиэтиленовые ПП1 КШ 7/16, ПП1 КШ 10/19, ПП1 КШ 14/23 и ПП1 КШ 29/32.
  • Пробки стеклянные пришлифованные ПМ1 КШ 7/16, ПМ1 КШ 10/19, ПМ1 КШ 14/23 и ПМ1 КШ 29/32 по ГОСТ 25336-82.
  • Дозаторы медицинские лабораторные переменного объема (пипет-дозаторы) с диапазоном дозирования (20-200) мм3 и (100-1000) мм3 по ГОСТ 28311.
  • Ёмкость для элюента вместимостью 1000 см3.
  • Емкости из полиэтилена с плотными крышками объемом 250 см3, изготовленные по ISO 9001.

4. Реактивы

  • Агидол (2,6-дитретбутил-4-метилфенол), Sigma-Aldrich, содержание основного вещества – не менее 99,0%.
  • Ацетонитрил (УФ-200 или УФ-210) для ВЭЖХ, квалификации «о.с.ч.» по ТУ 6-09-14-2167.
  • Тетрагидрофуран для ВЭЖХ, квалификации «о.с.ч.» по ТУ 5-02-621, массовая доля тетрагидрофурана – 99,9%.
  • Спирт изопропиловый квалификации «о.с.ч.» по ТУ 6-09-07-1718.
  • Спирт этиловый по ГОСТ Р 51652 , массовая доля спирта этилового – 96% (для установления чистоты образцовых веществ витаминов А и Е).
  • н-Гексан, квалификации «х.ч.», Merck, с содержанием основного вещества не менее 95% (для установления чистоты образцового вещества витамина D3).
  • Метилен хлористый (дихлорметан) квалификации «о.с.ч.» по ТУ 6-09-20-30.
  • Натрия гидроокись квалификации «ч.д.а.» по ГОСТ 4328.
  • Ацетон технический по ГОСТ 2768-84 (для мытья посуды).
  • Калий двухромовокислый, квалификации «х.ч.» по ГОСТ 4220-75 (для мытья посуды).
  • Кислота серная, квалификации «ч.» по ГОСТ 4204-77 (для мытья посуды).
  • Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.

5. Стандартные образцы

  • Ретинола ацетат (витамин А), Fluka, содержание основного вещества – не менее 95%.
  • Альфа-токоферола ацетат (α-токоферола ацетат, витамин Е), Aldrich, содержание основного вещества – не менее 96%.
  • Холекальциферол (витамин D3), Fluka, содержание основного вещества – не менее 99%.

_storage_files_methodologies_ru_0_214_25_1s.jpg

Название Колонка Детектор
Жирорастворимые витамины в спреде «Матренкино» Luna C18(2) 250х4.6 мм 5 мкм Спектрофотометрический
Стандартная смесь жирорастворимых витаминов 2 Synergi Fusion-RP 250х4.6 мм 4 мкм Спектрофотометрический
Миниатюра схемы