Методика выполнения измерений массовой доли охратоксина А в пищевых продуктах, продовольственном сырье и комбикормах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Свидетельство №42-09 от 21.08.2009, ФР.1.31.2012.13727

1. Объекты исследования

Настоящая методика устанавливает метод измерений массовой доли охратоксина А в зерне, зерновых, крупяных, зернобобовых и масличных культурах, муке, крупе, хлебе, хлебобулочных и макаронных изделиях, орехах, комбикормах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

2. Диапазон измерений

Диапазоны измерений массовой концентрации охратоксина А в различных объектах указаны в таблице.

Наименование
объекта
Диапазон
измерений
массовой
доли охра-
токсина А,
мг/кг
Показатель
точности
(границы
относительной
погрешности),
 ±δ, %,
при Р=0,95
Показатель
повторяемости
(относительное
среднеквадрати-
ческое отклонение
повторяемости),
σr, %
Показатель
воспроизводимости
(относительное
среднеквадрати-
ческое отклонение
воспроизводимости),
σR , %
Предел
повторяемости,
 r, %,
P=0,95, n=2
Зерно, зерновые,
крупяные, зернобобовые
и масличные культуры,
мука, крупа, хлеб,
хлебобулочные и
макаронные изделия,
орехи,  комбикорма
от 0,0005
до 0,005 вкл.
35 10 15 28
свыше 0,005
до 0,02 вкл.
25 5 10 15

 

3. Пробоподготовка

Подготовка проб к измерениям включает следующие этапы:

  • первичное извлечение охратоксина А из пробы;
  • экстракция охратоксина А из пробы методом твердофазной экстракции;
  • очистка пробы на ТФЭ-картридже;
  • – элюирование охратоксина А с ТФЭ-картриджа и подготовка пробы для ввода в хроматограф.

Для анализа готовят две параллельные пробы.

Блок-схема процедуры пробоподготовки

4. Проведение хроматографического анализа

4.1. Оборудование и условия для проведения ВЭЖХ-анализа градуировочных растворов охратоксина А и подготовленной пробы

Для хроматографического определения охратоксина А необходимо использовать изократическую высокоэффективную жидкостную хроматографическую систему с флуориметрическим детектором.

Для проведения анализа предварительно готовят градуировочные растворы охратоксина А, проводят пробоподготовку, подготавливают к работе прибор.

Оборудование:

  • хроматограф жидкостный «Стайер М» с флуориметрическим детектором;
  • персональный компьютер  с установленным программным обеспечением «МультиХром».

Условия:

  • изократический режим;
  • колонка: «Synergi Hydro-RP» 4 мкм 250х4,6 мм (Phenomenex, США);
  • защитная колонка: «С18 Aq» или «С18» 4x3,0 мм (Phenomenex, США);
  • подвижная фаза: раствор аммония хлористого молярной концентрации 20 ммоль/дм3, pH 9,6–9,8 – ацетонитрил (81,5:18,5);
  • скорость потока: 0,75 см3/мин;
  • объем петлевого дозатора: 20 мкл;
  • температура: комнатная;
  • детектирование: флуориметрическое, λex 365±2 нм, λem 405-600 нм.

Градуировку проводят по градуировочным растворам во всем диапазоне измеряемых концентраций не реже 1 раза в месяц, а также при использовании новой партии реактивов, замене колонок и после ремонта хроматографа.

4.2. Определение количественного содержания охратоксина А в пробе

Для получения результата измерений проводят анализ двух параллельных проб, для каждой из которых выполняют по два измерения (получают по две хроматограммы). Результат измерений (С) – массовая концентрация охратоксина А в пробе, введенной в хроматограф, рассчитывается автоматически системой сбора и обработки хроматографической информации.

Если массовая концентрация пробы, введенной в хроматограф, оказывается больше верхней границы диапазона градуировки (50 нг/см3), пробу перед вводом в хроматограф разбавляют подвижной фазой, но не более, чем в 10 раз. Разбавление учитывают при расчете.

Рассчитывают среднее арифметическое значение массовой концентрации охратоксина А в пробах, введенных в хроматограф (C1 и C2), по результатам двух измерений для каждой из параллельных проб по формуле

Сср  = ( С1 + С2 ) / 2

Массовую долю охратоксина А в анализируемой пробе Спр, [мг/кг] рассчитывают по формуле:

{IMAGE3} где:
Сср – среднее значение массовой концентрации охратоксина А в пробе, введенной в хроматограф [нг/см3];
V1 – объем толуолового экстракта 50 см3;
V2 – объем пробы, взятой на анализ 25 см3;
V3 – измеренный объем пробы [см3];
M – масса пробы 10 г;
Kэкстр – коэффициент твёрдофазной экстракции 0,75;
10-3 – коэффициент пересчета в мг/кг;
Kразб – коэффициент разбавления.

За результат измерений принимают среднее арифметическое значение массовой доли охратоксина А в двух параллельных пробах.

1. Основное оборудование

Хроматограф жидкостный «Стайер М» по ТУ 4215-032-81696414-12 в составе:

2. Вспомогательное оборудование и оборудование для пробоподготовки

  • Персональный компьютер (процессор Intel Core i3 или более производительный, объём оперативной памяти не менее 8 Гб, последовательный порт или MOXA) с установленной операционной системой Windows 10, монитор, лазерный принтер.
  • Установка для вакуумной фильтрации и дегазации вместимостью 500 см3 (Phenomenex) или колба Бунзена 2-250-29/32 ТС и воронка Бюхнера по ГОСТ 25336-82.
  • Насос вакуумный, производительность – 5,5 дм3/мин, разряжение – 160 мбар, или насос, обеспечивающий разряжение не менее 400 мм рт. ст., способный работать с органическими растворителями.
  • Фильтры мембранные фторопластовые (PTFE) и нейлоновые (Nylon), диаметр 45 мм, диаметр пор 0,45 мкм (Phenomenex, США) или фильтры обеззоленные «синяя лента» по ТУ 6-09-1678 (вместо нейлоновых фильтров).
  • Вакуумная установка для твердофазной экстракции (ТФЭ) в комплекте с адаптером и резервуаром.
  • Картриджи для твердофазной экстракции Strata NH2 60мг/3мл (Phenomenex).

3. Общелабораторное оборудование

  • Весы лабораторные электронные с наибольшим пределом взвешивания 200 г, класс точности "специальный" по ГОСТ 24104-2001.
  • Ванна ультразвуковая, диапазон частоты (20-40) кГц, мощность не менее 50 Вт.
  • Мешалка магнитная, диапазон скорости вращения (120–1500) об/мин.
  • Центрифуга «ОПН-8» со скоростью вращения ротора не менее 8000 об/мин и пластиковыми пробирками объемом не менее 25 см3.
  • рН-метр HI 9321, "Hanna Instruments".
  • Аквадистиллятор по ГОСТ 28165-89.
  • Шкаф суховоздушный лабораторный ШСвЛ-80 «Касимов».
  • Пипетки лабораторные стеклянные градуированные, 2 класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 см3 по ГОСТ 29227-91.
  • Пипетки лабораторные стеклянные концевые градуированные, 2 класса точности вместимостью 2 см3 по ГОСТ 29227-91.
  • Посуда мерная лабораторная стеклянная 2 класса точности по ГОСТ 1770-74:
    • колбы мерные наливные вместимостью 10, 25, 50, 100, 500 и 1000 см3;
    • цилиндры вместимостью 25, 50, 100, 200, 250 и 1000 см3;
    • пробирки с узким дном вместимостью 10 см3.
  • Колбы конические КН-1-25-14/23 и КН-1-250-29/32 по ГОСТ 25336-82.
  • Стаканы лабораторные стеклянные В(Н)-1-1000 ТС со шкалой по ГОСТ 25336-82 или стаканы лабораторные стеклянные вместимостью 1000 см3 по ISO 3819.
  • Склянки из темного стекла с герметично закрывающимися крышками, вместимостью 25, 50, 500 и 1000 см3 по ГОСТ 25336-82.
  • Пробки полиэтиленовые ПП1 КШ 7/16, ПП1 КШ 10/19, ПП1 КШ 14/23 и ПП1 КШ 29/32.
  • Пробки стеклянные пришлифованные ПМ1 КШ 7/16, ПМ1 КШ 10/19, ПМ1 КШ 14/23 и ПМ1 КШ 29/32 по ГОСТ 25336-82.
  • Пипетки Мора вместимостью 25 см3 2 класса точности по ГОСТ 29227–91.
  • Ёмкость для элюента вместимостью 500 см3.

4. Реактивы

  • Ацетон технический по ГОСТ 2768-84(для мытья посуды).
  • Ацетонитрил (УФ-200 или УФ-210) для ВЭЖХ, квалификации «о.с.ч.» по ТУ 6-09-14-2167, массовая доля ацетонитрила 99,9 %.
  • Толуол, квалификации «ч.д.а.» по ГОСТ 5789-78.
  • Гексан, квалификации «х.ч.» по ГОСТ 2631-003-05807999-98.
  • Кислота соляная, квалификации «х.ч.» по ГОСТ 3118-77.
  • Кислота уксусная ледяная, квалификации «х.ч.» по ГОСТ 61-75.
  • Аммиак водный, квалификации «о.с.ч.» по ГОСТ 24147-80.
  • Магний хлористый шестиводный по ГОСТ 4209-77.
  • Натрий сернокислый безводный, квалификации «х.ч.» по ГОСТ 4166-78.
  • Аммоний хлористый, квалификации «х.ч.» по ГОСТ 3773-72.
  • Калий двухромовокислый, квалификации «х.ч.» по ГОСТ 4220-75 (для мытья посуды).
  • Кислота серная, квалификации «ч.» по ГОСТ 4204-77 (для мытья посуды).
  • Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.

5. Стандартные образцы

  • Раствор охратоксина А (СОП 0015-97) в ацетонитриле с аттестованным значением массовой концентрации 50,0 мкг/см3 ± 5%

_storage_files_methodologies_ru_0_229_27_1s.jpg

Название Колонка Детектор
Охратоксин А в пробе зерна Synergi Hydro-RP 250х4.6 мм 4 мкм Флуориметрический
Миниатюра схемы