Методика выполнения измерений массовой доли афлатоксинов В1, В2, G1 и G2 в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

1. Объекты исследования

Настоящая методика выполнения измерений распространяется на муку пшеничную, в т.ч. макаронные изделия, ржаную, тритикалевую, кукурузную, ячменную, просяную (пшенную), рисовую, гречневую, сорговую; хлебобулочные изделия, пирожные, торты; сою, пряности, орехи, семечки и устанавливает метод определения массовой концентрации афлатоксинов В1, В2, G1 и G2 при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии с предколоночной дериватизацией и флуориметрическим детектированием.

2. Диапазон измерений

Наиболее часто в продуктах питания встречается афлатоксин В1. Значение ПДК для В1 в муке пшеничной, в т.ч. макаронных изделиях, ржаной, тритикалевой, кукурузной, ячменной, просяной (пшенной), рисовой, гречневой, сорговой, согласно СанПиН 2.3.2.1078-01 (п. 1.4.4.), составляет 5 мкг/кг (0,005 мг/кг).

Содержание афлатоксинов В2, G1, G2 (ПДК) на территории РФ не нормируется. В европейских странах суммарное содержание афлатоксинов В2, G1 и G2 нормируется в пределах 2-8 мкг/кг, не считая особых требований к детскому питанию.

Данная методика позволяет одновременно определять содержание афлатоксинов В1, В2, G1 и G2 в продуктах питания в концентрациях от 2,5 до 10 мкг/кг (для В1 и В2 по каждому отдельно), от 5 до 20 мкг/кг для G1 и от 0,5 до1,0 мкг/кг для G2.

3. Пробоподготовка

Для анализа афлатоксинов используют свободные от посторонних примесей и продуктов жизнедеятельности животных и микроорганизмов (плесени) пробы.

Твердые изделия (макароны, сушки, сухари) предварительно измельчают в блендере до состояния гомогенной массы.

Орехи, кондитерские изделия (торты, пирожные), хлеб и хлебобулочные изделия (булки) для обеспечения однородности пробы и удаления избыточной влаги смешивают с натрием сернокислым в соотношении 1:3 (по массе) и гомогенизируют в блендере до состояния гомогенной массы.

Пробы муки (различных сортов) и пряностей в виде порошка (перец, корица) не требуют предварительного измельчения.

Пробу продукта (измельченную, гомогенизированную) экстрагируют ацетонитрилом, экстракт фильтруют через фильтрующую насадку PTFE (0.45 мкм, d=30 мм) с помощью одноразового шприца, к фильтрату приливают заданный объем дистиллированной воды, полученную эмульсию подвергают очистке с помощью твердофазной экстракции на картриджах Strata C18-E, собранный с картриджа элюат отдувают до заданного объема. К сконцентрированному после отдувки элюату добавляют раствора йода и оставляют на 20 мин при комнатной температуре.

Примечание. Из-за заметного гашения флуоресценции в протонных растворителях чувствительность прямого флуориметрического определения афлатоксинов В1 и G1 (в отличие от G2 и B2) оказывается неудовлетворительной. Для удовлетворительного определения афлатоксинов B1 и G1 в данной методике предложено использовать предколоночную дериватизацию раствором йода. Время, необходимое для прохождения реакции дериватизации афлатоксинов B1 и G1, составляет 20 мин.

Дериватизированные производные (подготовленные пробы) хранят в темноте не более 12 часов.

Блок-схема процедуры пробоподготовки

4. Проведение хроматографического анализа

4.1. Оборудование и условия для проведения ВЭЖХ-анализа градуировочных растворов афлатоксинов, подготовленной пробы продукта.

Для хроматографического определения афлатоксинов необходимо использовать изократическую высокоэффективную жидкостную хроматографическую систему с флуориметрическим детектированием.

Для проведения анализа предварительно готовят рабочие растворы из СОП афлатоксинов в ацетонитриле или из СОП афлатоксинов в бензоле (путем перерастворения в ацетонитриле), далее готовят градуировочные растворы путем подкисления рабочих растворов смесью дистиллированная вода – уксусная кислота и дериватизации раствором йода (рабочий раствор – «кислая вода» – раствор йода (1:8:1, по объему)); проводят пробоподготовку; подготавливают к работе прибор.

Оборудование:

• хроматограф жидкостный «Стайер М» с флуориметрическим детектором;
• персональный компьютер с установленным программным обеспечением «МультиХром».

Условия:

• изократический режим;
• колонка: Synergi Hydro-RP 250х4,6 мм 4 мкм (Phenomenex, США);
• защитная колонка: С18 4x3,0 мм или С18 Aq 4x3,0 мм (Phenomenex, США);
• подвижная фаза: н-бутанол – ацетонитрил – дистиллированная вода – уксусная кислота (8:14:76:1);
• скорость потока: 0,9 мл/мин;
• объем петли: 20 мкл;
• температура: 50°С;
• диапазон RFU: 0,005;
• детектирование: флуориметрическое (λex: 365±2 нм; λem: 400-460 нм).

Градуировку во всем диапазоне измеряемых концентраций проводят не реже 1 раза в 2 недели, а также при использовании новой партии реактивов, замене колонок и после ремонта хроматографа.

4.2. Определение количественного содержания афлатоксинов в пробе продукта.

Для определения количественного содержания компонентов пробы (афлатоксинов) проводят хроматографический анализ одного из градуировочных растворов и далее хроматографический анализ подготовленной пробы. Для достоверности измерений хроматографический анализ как градуировочного раствора, так и подготовленной пробы проводят не менее 2 раз подряд.

В программе «МультиХром» в отчёте или над пиком (в зависимости от установок опций «ВИД») отображается измеренное значение концентрации в пробе, введенной в хроматограф (но не в исходном образце, взятом для исследования!).

Для получения результата необходимо провести как минимум два параллельных измерения (получить две хроматограммы). За результат измерений принимают среднее арифметическое значение содержания каждого из афлатоксинов в концентрате анализируемой пробы, мкг/л.

Массовую долю афлатоксинов в анализируемой пробе (в исходном образце) Х, мкг/кг, рассчитывают по формуле:

где:
С_хр – среднее значение концентрации афлатоксина, полученное в результате хроматографирования в двух параллельных измерениях [мкг/л];
V₁ – объем исходного экстракта, фактически равный объему ацетонитрила, взятого для первичной экстракции (15 мл) [мл];
V₂ – объем отфильтрованного экстракта (фильтрат), взятого для дальнейшей обработки, (5 мл) [мл];
V₃ – объем пробы после отдувки ТФЭ-экстракта (около 1 мл) [мл];
K_экстр.1 – коэффициент первичной жидкостной экстракции ацетонитрилом;
K_{ТФЭэкстр.2} – коэффициент твердофазной экстракции афлатоксина;
m_пр – масса пробы продукта, взятого на анализ [г].