Методика выполнения измерений массовой доли афлатоксинов В1, В2, G1 и G2 в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Свидетельство №29-08 от 04.03.2008 ФР.1.31.2008.04629

1. Объекты исследования

Настоящая методика выполнения измерений распространяется на муку пшеничную, в т.ч. макаронные изделия, ржаную, тритикалевую, кукурузную, ячменную, просяную (пшенную), рисовую, гречневую, сорговую; хлебобулочные изделия, пирожные, торты; сою, пряности, орехи, семечки и устанавливает метод определения массовой концентрации афлатоксинов В1, В2, G1 и G2 при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии с предколоночной дериватизацией и флуориметрическим детектированием.

2. Диапазон измерений

Наиболее часто в продуктах питания встречается афлатоксин В1. Значение ПДК для В1 в муке пшеничной, в т.ч. макаронных изделиях, ржаной, тритикалевой, кукурузной, ячменной, просяной (пшенной), рисовой, гречневой, сорговой, согласно СанПиН 2.3.2.1078-01 (п. 1.4.4.), составляет 5 мкг/кг (0,005 мг/кг).

Содержание афлатоксинов В2, G1, G2 (ПДК) на территории РФ не нормируется. В европейских странах суммарное содержание афлатоксинов В2, G1 и G2 нормируется в пределах 2-8 мкг/кг, не считая особых требований к детскому питанию.

Данная методика позволяет одновременно определять содержание афлатоксинов В1, В2, G1 и G2 в продуктах питания в концентрациях от 2,5 до 10 мкг/кг (для В1 и В2 по каждому отдельно), от 5 до 20 мкг/кг для G1 и от 0,5 до1,0 мкг/кг для G2.

3. Пробоподготовка

Для анализа афлатоксинов используют свободные от посторонних примесей и продуктов жизнедеятельности животных и микроорганизмов (плесени) пробы.

Твердые изделия (макароны, сушки, сухари) предварительно измельчают в блендере до состояния гомогенной массы.

Орехи, кондитерские изделия (торты, пирожные), хлеб и хлебобулочные изделия (булки) для обеспечения однородности пробы и удаления избыточной влаги смешивают с натрием сернокислым в соотношении 1:3 (по массе) и гомогенизируют в блендере до состояния гомогенной массы.

Пробы муки (различных сортов) и пряностей в виде порошка (перец, корица) не требуют предварительного измельчения.

Пробу продукта (измельченную, гомогенизированную) экстрагируют ацетонитрилом, экстракт фильтруют через фильтрующую насадку PTFE (0.45 мкм, d=30 мм) с помощью одноразового шприца, к фильтрату приливают заданный объем дистиллированной воды, полученную эмульсию подвергают очистке с помощью твердофазной экстракции на картриджах Strata C18-E, собранный с картриджа элюат отдувают до заданного объема. К сконцентрированному после отдувки элюату добавляют раствора йода и оставляют на 20 мин при комнатной температуре.

Примечание. Из-за заметного гашения флуоресценции в протонных растворителях чувствительность прямого флуориметрического определения афлатоксинов В1 и G1 (в отличие от G2 и B2) оказывается неудовлетворительной. Для удовлетворительного определения афлатоксинов B1 и G1 в данной методике предложено использовать предколоночную дериватизацию раствором йода. Время, необходимое для прохождения реакции дериватизации афлатоксинов B1 и G1, составляет 20 мин.

Дериватизированные производные (подготовленные пробы) хранят в темноте не более 12 часов.

Блок-схема процедуры пробоподготовки

Блок-схема процедуры пробоподготовки

 

4. Проведение хроматографического анализа

4.1. Оборудование и условия для проведения ВЭЖХ-анализа градуировочных растворов афлатоксинов, подготовленной пробы продукта.

Для хроматографического определения афлатоксинов необходимо использовать изократическую высокоэффективную жидкостную хроматографическую систему с флуориметрическим детектированием.

Для проведения анализа предварительно готовят рабочие растворы из СОП афлатоксинов в ацетонитриле или из СОП афлатоксинов в бензоле (путем перерастворения в ацетонитриле), далее готовят градуировочные растворы путем подкисления рабочих растворов смесью дистиллированная вода – уксусная кислота и дериватизации раствором йода (рабочий раствор – «кислая вода» – раствор йода (1:8:1, по объему)); проводят пробоподготовку; подготавливают к работе прибор.

Оборудование:

  • хроматограф жидкостный «Стайер М» с флуориметрическим детектором;
  • персональный компьютер с установленным программным обеспечением «МультиХром».

Условия:

  • изократический режим;
  • колонка: Synergi Hydro-RP 250х4,6 мм 4 мкм (Phenomenex, США);
  • защитная колонка: С18 4x3,0 мм или С18 Aq 4x3,0 мм (Phenomenex, США);
  • подвижная фаза: н-бутанол – ацетонитрил – дистиллированная вода – уксусная кислота (8:14:76:1);
  • скорость потока: 0,9 мл/мин;
  • объем петли: 20 мкл;
  • температура: 50°С;
  • диапазон RFU: 0,005;
  • детектирование: флуориметрическое (λex: 365±2 нм; λem: 400-460 нм).

Градуировку во всем диапазоне измеряемых концентраций проводят не реже 1 раза в 2 недели, а также при использовании новой партии реактивов, замене колонок и после ремонта хроматографа.

4.2. Определение количественного содержания афлатоксинов в пробе продукта.

Для определения количественного содержания компонентов пробы (афлатоксинов) проводят хроматографический анализ одного из градуировочных растворов и далее хроматографический анализ подготовленной пробы. Для достоверности измерений хроматографический анализ как градуировочного раствора, так и подготовленной пробы проводят не менее 2 раз подряд.

В программе «МультиХром» в отчёте или над пиком (в зависимости от установок опций «ВИД») отображается измеренное значение концентрации в пробе, введенной в хроматограф (но не в исходном образце, взятом для исследования!).

Для получения результата необходимо провести как минимум два параллельных измерения (получить две хроматограммы). За результат измерений принимают среднее арифметическое значение содержания каждого из афлатоксинов в концентрате анализируемой пробы, мкг/л.

Массовую долю афлатоксинов в анализируемой пробе (в исходном образце) Х, мкг/кг, рассчитывают по формуле:

где:
Схр – среднее значение концентрации афлатоксина, полученное в результате хроматографирования в двух параллельных измерениях [мкг/л];
V1 – объем исходного экстракта, фактически равный объему ацетонитрила, взятого для первичной экстракции (15 мл) [мл];
V2 – объем отфильтрованного экстракта (фильтрат), взятого для дальнейшей обработки, (5 мл) [мл];
V3 – объем пробы после отдувки ТФЭ-экстракта (около 1 мл) [мл];
Kэкстр.1 – коэффициент первичной жидкостной экстракции ацетонитрилом;
KТФЭэкстр.2 – коэффициент твердофазной экстракции афлатоксина;
mпр – масса пробы продукта, взятого на анализ [г].

1. Основное оборудование

Хроматограф жидкостный «Стайер М» по ТУ 4215-032-81696414-12 в составе:

2. Вспомогательное оборудование и оборудование для пробоподготовки

  • Персональный компьютер (процессор Intel Core i3 или более производительный, объём оперативной памяти не менее 8 Гб, последовательный порт или MOXA) с установленной операционной системой Windows 10, монитор, лазерный принтер.
  • Устройство для фильтрации и дегазации растворов и фильтры мембранные (тефлоновые, PTFE). Предназначены для подготовки подвижной фазы в хроматографическом анализе, подключаются к водоструйному или вакуумному насосу.
  • Мининасос-компрессор KNF модель N 86 KT 18, производительность - 5,5 л/мин, разряжение - 160 мбар, давление до 2,5 бар, фторопластовая мембрана.
  • Вакуумная установка для твердофазной экстракции (ТФЭ) в комплекте с адаптером и резервуаром.
  • Картриджи для твердофазной экстракции strata C18-E 500мг/3мл для очистки экстрактов образцов 50 шт. в упаковке (в комплекте на 20 определений – 1 упаковка; в комплекте на 100 определений – 4 упаковки).
  • Фильтрующая насадка на шприц для предварительной фильтрации экстракта образца, тефлон 0.45 мкм, диаметр 30 мм.

3. Общелабораторное оборудование

  • Аналитические весы предел взвешивания 200 г, цена деления 0.1 мг с внешней калибровкой (например, весы аналитические AR2140).
  • УЗ ванна объемом не менее 5 л, с таймером, и возможностью нагрева, диапазон частоты 20 – 40 кГц, суммарная полезная мощность усилителя не менее 50 Вт (например, «Сапфир»).
  • Дистиллятор.
  • Устройство для отдувки образцов в токе воздуха (испарительный концентратор).
  • Компрессор безмаслянный производительность от 100 л/ч.
  • Комплект лабораторной посуды:
№ п/п Описание Коли-
чество
1 Пипетки мерные лабораторные стеклянные по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29169 2-го класса точности вместимостью 0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0 см3 по
5 шт.
2 Пипетка мерная лабораторная концевая стеклянная вместимостью 1,0 мл 1 шт.
3 Колбы мерные наливные по ГОСТ 1770 2-го класса точности вместимостью 10; 50; 100 см3 по
3 шт.
4 Цилиндр мерный по ГОСТ 1770 2-го класса точности вместимостью 100 см3 1 шт.
5 Цилиндр мерный по ГОСТ 1770 2-го класса точности вместимостью 50 см3 1 шт.
6 Цилиндр мерный по ГОСТ 1770 2-го класса точности вместимостью 25 см3 1 шт.
7 Пробирка мерная стеклянная градуированная с узким дном по ГОСТ 1770 2-го класса точности вместимостью 10 см3 4 шт.
8 Пробирки мерные стеклянные градуированные вместимостью 15 мл 4 шт.
9 Стакан широкий вместимостью 150 или 200 см3 1 шт.
10 Стеклянная емкость для подвижной фазы объемом 500 мл 1 шт.
11 Емкости (виалы) из темного стекла с герметично закрывающимися крышками объёмом 10 и 50 мл по
2 шт.
12 Палочка стеклянная 1 шт.
13 Механическое дозирующее устройство (Pumpipet) 1 шт.
14 Шприц медицинский пластиковый двухкомпонентный одноразовый на 5 мл 1 шт.
15 Шприц медицинский пластиковый двухкомпонентный одноразовый на 10 мл 1 шт.
16 Пипет-дозатор переменного объема 20-200 мм3 в комплекте с наконечниками (1000 шт) 1 шт.
17 Пипет-дозатор переменного объема 200-1000 мм3 в комплекте с наконечниками (1000 шт) 1 шт.

 

4. Комплект реактивов на 20 или 100 определений


п/п
Описание Количество
на 20
определений
Количество
на 100
определений
1 Ацетонитрил УФ 210нм 1.5 кг 6 кг
2 н-Бутанол, х.ч. (лучше ос.ч.) 0.2 кг 1 кг
3 Ледяная уксусная кислота, х.ч. 0.2 кг 1 кг
4 Изопропанол, х.ч. 0.2 кг 1 кг
5 Раствор йода спиртовой 5%-ный мин. фасовка
(надо 1 мл)
мин. фасовка
(надо 3 мл)
6 Сульфат натрия безводный, х.ч. мин. фасовка
(надо 3,6 кг)
18 кг
7 Натрий углекислый, х.ч. мин. фасовка
(надо 3 г)
мин. фасовка
(надо 13 г)

 

5. Комплект стандартных образцов


п/п
Описание Количество
1 Стандарт афлатоксина В1 (СОП 0004-97*) 0003-97* 1 ампула
2 Стандарт афлатоксина В2 (СОП 0009-97*) 0007-97* 1 ампула
3 Стандарт афлатоксина G1 (СОП 0009-97)* 1 ампула
4 Стандарт афлатоксина G2 (СОП 0011-97)* 1 ампула

* Допускается использование других стандартных образцов, в частности, образцов состава афлатоксинов, растворенных в смеси бензол – ацетонитрил (98:2)

_storage_files_methodologies_ru_0_207_17_1s.jpg

Название Колонка Детектор
Афлатоксины B1, B2, G1, G2 в пробе муки Synergi Hydro-RP 250х4.6 мм 4 мкм Флуориметрический
Афлатоксины B1, B2, G1, G2 в пробе пирожного Synergi Hydro-RP 250х4.6 мм 4 мкм Флуориметрический
Стандартная смесь афлатоксинов B1, B2, G1, G2 Synergi Hydro-RP 250х4.6 мм 4 мкм Флуориметрический
Миниатюра схемы