Продукты пищевые. Определение витамина В6 с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.
ГОСТ EN 14164-2014
Настоящий стандарт устанавливает метод определения витамина B6 в пищевых продуктах с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ). Витамин B6 представляет собой сумму массовых долей пиридоксина, пиридоксаля, пиридоксамина, включая их фосфорилированные продукты замещения, в пересчете на пиридоксин.
Пиридоксаль, пиридоксамин, пиридоксин извлекают из продуктов питания в ходе гидролиза в кислой среде и дефосфорилируют ферментативным путем, используя кислую фосфатазу. В результате реакции с глиоксиловой кислотой в присутствии Fe2+ в качестве катализатора пиридоксамин превращается в пиридоксаль, который далее переходит в пиридоксин под воздействием борогидрида натрия в щелочной среде.
Затем пиридоксин количественно определяют в растворе пробы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуориметрическим детектором.
Стеклянная посуда.
Спектрофотометр для УФ-области спектра, предназначенный для измерений оптической плотности при заданных длинах волн.
Нагревательный прибор. Печь или водяная баня с приспособлениями для встряхивания.
Система для высокоэффективной жидкостной хроматографии, состоящая из насоса, устройства для ввода пробы, флуоресцентного детектора с длинами волн возбуждения и регистрации, установленными на 290 и 395 нм соответственно, и системы обработки данных, например, интегратора.
ВЭЖХ-колонка, например, колонка для обращенно-фазовой хроматографии, такая как LiChrosper®60 RP С8 Select В, размер частиц 5 мкм, диаметр 4,0 мм, длина 250 мм.
Помимо указанных в настоящем стандарте, могут использоваться колонки других типоразмеров и с частицами другого размера. Параметры разделения должны быть адаптированы для таких материалов, чтобы гарантировать получение объективных результатов. Критерий эффективности для аналитических колонок - это полное разделение пиков рассматриваемых анализируемых веществ.
Фильтровальный прибор. Фильтрование подвижной фазы, а также исследуемого раствора пробы через мембранный фильтр, например с размером пор фильтра 0,45 мкм, перед использованием или впрыскиванием продлит срок службы колонок.
Кислая фосфатаза из картофеля, ферментная активность составляет 33 нанокатал/мг с субстратом нитрофенилфосфатом (при рН = 4,8 и температуре 37°С), например, производства Boehringer или Sigma. Активность 33 нанокатал/мг соответствует 2 U/мг.
Ацетат натрия трехводный (тригидрат), с массовой долей ω(CH3COONa·3H2O)≥99,0%.
Ледяная уксусная кислота, с массовой долей ω(CH3COOH)≥99,8%.
Глиоксиловая кислота, с массовой долей ω(C2H2O3·H2O)≥97,0%.
Сульфат железа (II) 7-водный (гептагидрат), с массовой долей ω(FeSO4·7H2O)≥99,5%.
Гидроксид натрия, с массовой долей ω(NaOH)≥99,0%.
Борогидрид натрия, с массовой долей ω(NaBH4)≥97,0%.
Дигидрофосфат калия, с массовой долей ω(KH2PO4)≥99,0%.
Пиридоксальфосфат (PLP), с массовой долей ω≥99,0%.
Ортофосфорная кислота, с массовой долей ω(H3PO4)≥84,0%.
1-Октансульфонат натрия, с массовой долей ω(C8H17NaO3S)≥98,0% или 1-гептансульфонат натрия, с массовой долей ω(C7H15NaO3S)≥98,0%.
Ацетонитрил (квалификации "для ВЭЖХ"), с массовой долей ω(C2H3N)≥99,8%.
Соляная кислота, c(HCI)=0,1 моль/дм3.
Соляная кислота, c(HCI)=0,2 моль/дм3.
Подвижная фаза для ВЭЖХ. В лабораторный стакан добавляют 940 см3 воды, 40 см3 ацетонитрила, 160 мг 1-октансульфоната натрия или 1-гептансульфоната натрия и 6,8 г дигидрофосфата калия. После растворения 1-октансульфоната натрия или 1-гептансульфоната натрия и дигидрофосфата калия устанавливают значение рН 2,5, используя ортофосфорную кислоту. Раствор переносят в мерную колбу вместимостью 1 дм3. Доводят до метки водой. Фильтруют через фильтр с размером пор 0,45 мкм.
Пиридоксина гидрохлорид (образец сравнения витамина B6), ω(C8H11NO3·HCl)≥99%
