Продукты пищевые. Определение витамина В2 с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.
ГОСТ EN 14152-2013
Настоящий стандарт устанавливает метод определения витамина B2 в пищевых продуктах с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Содержание витамина B2 определяется как содержание рибофлавина.
Метод основан на экстракции рибофлавина из пробы путем кислотного гидролиза, последующем ферментативном дефосфорилировании рибофлавина и его количественном определении с помощью ВЭЖХ с флюориметрическим детектированием.
Спектрофотометр, пригодный для измерений оптической плотности в видимой области спектра при заданной длине волны, в комплекте с кюветами длиной оптического пути 1 см..
Автоклав для экстракции проб с возможностью контроля температуры и давления или плитка электрическая, или баня водяная с контролем температуры.
Хроматограф жидкостный. Система для ВЭЖХ, состоящая из насоса, инжектора, флюориметрического детектора, позволяющего проводить измерения при длине волны возбуждения 468 нм и длине волны эмиссии 520 нм, и устройства регистрации и обработки аналитического сигнала, например, интегратора.
Колонка внутренним диаметром от 4,0 мм до 4,6 мм, длиной от 100 мм до 250 мм, заполненная обращенно-фазовым сорбентом размером частиц от 3 мкм до 10 мкм. Допускается использовать колонку других размеров, заполненную сорбентом другого размера частиц, по сравнению с теми, что указаны в настоящем стандарте. Условия хроматографического разделения подбирают применительно к используемой колонке для обеспечения сопоставимости результатов анализов.
Установка для фильтрации подвижной фазы перед ее использованием и раствора пробы для хроматографического анализа перед инжекцией через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм (продлевает срок службы аналитической колонки).
Система для послеколоночной дериватизации, состоящая из насоса для подачи реактива для дериватизации, соединительного элемента для трех капилляров и реактора в виде капилляра длиной 10 м и внутренним диаметром 0,33 мм.
Метанол для ВЭЖХ чистотой не менее 99,8%.
Натрий уксуснокислый трехводный чистотой не менее 99 %.
Натрий уксуснокислый, раствор молярной концентрации c(CH3COONa·3H2O)= 0,1 моль/дм3.
Натрий уксуснокислый, раствор молярной концентрации c(CH3COONa·3H2O)= 2,5 моль/дм3.
Кислота уксусная ледяная чистотой не менее 99,8 %.
Кислота уксусная, раствор молярной концентрации c(CH3COOH)=0,02 моль/дм3.
Кислота соляная массовой долей 36%.
Кислота соляная, раствор молярной концентрации c(HCl)=0,1 моль/дм3.
Кислота соляная, раствор молярной концентрации c(HCl)=0,01 моль/дм3.
Кислота серная, раствор молярной концентрации c(H2SO4)=0,05 моль/дм3.
Натрия гидроокись чистотой не менее 99%.
Натрия гидроокись, раствор молярной концентрации с(NaOH)= 0,5 моль/дм3.
Фосфора пентоксид чистотой не менее 98 %.
Дефосфорилирующий фермент, пригодный для гидролиза связанного рибофлавина в пробе. При установлении характеристик прецизионности методики использована Така-диастаза № Т00040 (Platz and Bauer, Waterbury, СТ 06708, США).
Подвижные фазы для ВЭЖХ. Варианты подвижных фаз подходящего состава приведены в приложениях A и С. В качестве подвижных фаз используют смеси метанола с водой, фосфатным или ацетатным буферным раствором при объемной доле метанола от 10 % до 50 %, а также подвижные фазы с добавлением ион-парных реагентов.
Раствор буферный фосфатный (pH = 3,5) молярной концентрации однозамещенного фосфата калия c(KH2PO4) = 9,0 ммоль/дм3.
Тетраэтиламмония хлорид чистотой не менее 98 %.
Натрия гептансульфонат чистотой не менее 98 %.
Рибофлавин (C17H20N4O6) чистотой не менее 98 %.
Натриевая соль рибофлавин-5'-фосфата (C17H20N4NaO9P) чистотой не менее 95 %.
