Методика выполнения измерений массовой концентрации сорбиновой и бензойной кислот в напитках методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
Свидетельство №23-08 от 04.03.2008, ФР.1.31.2008.01736
1. Объекты исследования
Настоящая методика выполнения измерений распространяется на напитки (вино и виноматериалы, пиво-безалкогольные напитки и соки) и устанавливает определение массовой концентрации сорбиновой и бензойной кислот методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием спектрофотометрического детектирования.
2. Диапазон измерений
Диапазоны измерений массовой концентрации сорбиновой и бензойной кислот в пробе продукта представлены в таблице 1.
Таблица 1. Диапазоны измерения массовой концентрации сорбиновой и бензойной кислот в продукте.
| Анализируемая кислота | Диапазон измерения массовой концентрации, мг/л |
|---|---|
| Сорбиновая кислота | 10-500 |
| Бензойная кислота | 20-500 |
3. Пробоподготовка
Отбор проб вина, напитков безалкогольных, сиропов, кваса, соков фруктовых, пива осуществляют в стеклянные емкости (колбы на 50 мл), предварительно вымытые и тщательно высушенные.
Пробоподготовка состоит из стадий отбора пробы и трехкратного фильтрования пробы через нейлоновый фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Трехкратное фильтрование обеспечивает удовлетворительную очистку пробы от сопутствующих веществ.
Для напитков, содержащих взвеси (квасы, соки и пр.) пробоподготовка состоит из стадий отбора пробы, центрифугирования и однократного фильтрования супернатанта через нейлоновый фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.
Хранение проб производят в стеклянных емкостях.
Блок-схема процедуры пробоподготовки
4. Проведение хроматографического анализа
4.1. Оборудование и условия для проведения ВЭЖХ-анализа градуировочных растворов сорбиновой и бензойной кислот, подготовленной пробы напитка.
Для хроматографического разделения сорбиновой и бензойной кислот следует использовать изократическую высокоэффективную хроматографическую систему со спектрофотометрическим детектированием в УФ-области.
При анализе сорбиновой и бензойной кислот допустимо использовать колонки различной длины (150 мм и 250 мм). Выбор той или иной колонки зависит от наличия их в лаборатории или от предпочтения аналитика.
Для проведения анализа предварительно готовят градуировочные растворы из ГСО или навесок солей; проводят пробоподготовку; подготавливают к работе прибор.
Оборудование:
- хроматограф жидкостный «Стайер М» с спектрофотометрическим детектором;
- персональный компьютер с установленным программным обеспечением «МультиХром».
Условия:
- изократический режим;
- колонка: Luna С18(2) 250х4,6 мм или 150х4,6 мм 5 мкм(Phenomenex, США);
- защитная колонка: С18 4x3,0 мм (Phenomenex, США);
- подвижная фаза: раствор 22% ацетонитрил/вода + 0,5% H3PO4 для колонки Luna С18(2) 250х4,6 мм; раствор 17% ацетонитрил/вода + 0.5% H3PO4 для колонки Luna С18(2) 150х4,6 мм;
- скорость потока: 1,0 мл/мин;
- объем петли: 20 мкл;
- температура: 35°С;
- детектирование: спектрофотометрическое; длина волны 230 нм (для анализа сорбиновой и бензойной кислот), 254 нм (для анализа сорбиновой кислоты)*
* При длине волны 254 нм детектируется пик сорбиновой кислоты, отклик пика бензойной кислоты очень слабый. Поэтому, при анализе бензойной кислоты, а также смеси сорбиновой и бензойной кислот детектирование следует проводить при длине волны 230 нм.
В рамках данной методики возможно определение таких компонентов как кофеин, аспартам, сахарин. При необходимости измерения их содержания в напитках, наряду с сорбиновой и бензойной кислотами, выбор длины волны детектирования обусловлен наличием в образце сильно окрашенных пищевых красителей.
Градуировку проводят по градуировочным растворам (во всем диапазоне определяемых концентраций) не реже 1 раза в квартал, а также при использовании новой партии реактивов, замене колонок и после ремонта хроматографа.
4.2. Определение количественного содержания сорбиновой и бензойной кислот в пробе.
Для определения количественного содержания компонентов пробы (сорбиновой и бензойной кислот) проводят хроматографический анализ одного из градуировочных растворов и далее хроматографический анализ подготовленной пробы. Для достоверности измерений хроматографический анализ как градуировочного раствора, так и подготовленной пробы проводят не менее 2 раз подряд.
При использовании программного обеспечения «МультиХром» в отчете или над пиком (в зависимости от установок опций «ВИД») по окончании измерения автоматически определяется результат в виде концентрации определяемых кислот. Для получения результата необходимо провести два параллельных измерения (получить две хроматограммы).
Массовую концентрацию анализируемых кислот (мг/л) рассчитывают как среднее арифметическое значение из двух параллельных измерений.
1. Основное оборудование
Хроматограф жидкостный «Стайер М» по ТУ 4215-032-81696414-12 в составе:
- насос изократический в стальном исполнении (SS 316);
- детектор спектрофотометрический UVV-105;
- устройство ввода образца (ручной инжектор или автосамплер);
- необходимый стартовый набор капилляров, фитингов и уплотнений для сборки системы и обеспечения работы в течение гарантийного периода (в полимерном исполнении);
- шприц дозирующий Hamilton для ввода образца объёмом 100 мкл;
- аналитическая колонка Luna C18(2) 250х4,6 мм или 150х4,6 мм 5 мкм в комплекте с защитной колонкой C18 4х3,0 мм и держателем (Phenomenex);
- программное обеспечение для сбора и обработки данных «МультиХром».
2. Вспомогательное оборудование и оборудование для пробоподготовки
- Персональный компьютер (процессор Intel Core i3 или более производительный, объём оперативной памяти не менее 8 Гб, последовательный порт или MOXA) с установленной операционной системой Windows 10, монитор, лазерный принтер.
- Устройство для фильтрации и дегазации растворов и фильтры мембранные (фторопластовые). Предназначены для подготовки подвижной фазы в хроматографическом анализе, подключаются к водоструйному или вакуумному насосу.
- Насос вакуумный, обеспечивающий разряжение не менее 400 мм рт. ст. и способный работать с органическими растворителями (например, мининасос-компрессор KNF модель N 86 KT 18).
- Термостат колонок TSС-003.
- Фильтрующая насадка на шприц Nylon 0,45 мкм диаметр 30 мм (Phenomenex) для предварительной фильтрации образца.
3. Общелабораторное оборудование
- Аналитические весы предел взвешивания 200 г, цена деления 0.1 мг с внешней калибровкой (например, весы аналитические AR2140).
- УЗ ванна объемом не менее 5 л, с таймером, и возможностью нагрева, диапазон частоты 20 – 40 кГц, суммарная полезная мощность усилителя не менее 50 Вт (например, «Сапфир»).
- Дистиллятор.
- Центрифуга со скоростью вращения ротора не менее 8000 об/мин (например ОПН-8, ротор РУ-180Л) и комплектом пластиковых пробирок.
- Комплект лабораторной посуды:
| № п/п | Описание | Коли- чество |
|---|---|---|
| 1 | Пипетки мерные лабораторные стеклянные по по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29169 2-го класса точности вместимостью 10,0 см3 25,0 см3 50,0 см3 |
3 шт. 3 шт. 3 шт. |
| 2 | Колбы мерные наливные по ГОСТ 1770 2-го класса точности вместимостью 50 см3 100 см3 1000 см3 |
3 шт. 3 шт. 2 шт. |
| 3 | Цилиндр мерный по ГОСТ 1770 2-го класса точности вместимостью 1000 см3 |
1 шт. |
| 4 | Колба стеклянная коническая 50 см3 | 4 шт. |
| 5 | Ёмкости из боросиликатного стекла с притёртыми пробками объёмом 50 см3 100 см3 |
4 шт. 2 шт. |
| 6 | Шприц медицинский пластиковый двухкомпонентный одноразовый на 5 мл | 1 шт. |
| 7 | Механическое дозирующее устройство (Pumpipet) | 1 шт. |
| 8 | Пипет-дозатор переменного объема 20-200 мм3 в комплекте с наконечниками (1000 шт) | 1 шт. |
| 9 | Пипет-дозатор переменного объема 200-1000 мм3 в комплекте с наконечниками (1000 шт) | 1 шт. |
4. Комплект реактивов на 20 или 100 определений
| № п/п |
Описание | Количество на 20 определений |
Количество на 100 определений |
|---|---|---|---|
| 1 | Ацетонитрил УФ 210, х.ч. | 1 кг | 3 кг |
| 2 | Кислота ортофосфорная, х.ч. | 30 г (мин.фасовка) |
150 г (мин.фасовка) |
5. Комплект стандартных образцов
| № п/п |
Описание | Количество |
|---|---|---|
| 1 | Сорбат калия, х.ч. | 0,134 г |
| 2 | Бензоат натрия, х.ч. | 0,118 г |
| Название | Колонка | Детектор |
|---|---|---|
| Стандартная смесь добавок к безалкогольным напиткам | Luna C18(2) 250х4.6 мм 5 мкм | Спектрофотометрический |
| Кофеин и консерванты в безалкогольном напитке | Luna C18(2) 250х4.6 мм 5 мкм | Спектрофотометрический |
