Методика выполнения измерений массовой концентрации охратоксина А в вине, соках и безалкогольных напитках методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
Свидетельство №35-08 от 04.03.2008, ФР.1.31.2008.04628
1. Объекты исследования
Настоящая методика устанавливает метод измерений массовой концентрации охратоксина А в вине, соках и безалкогольных напитках методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
2. Диапазон измерений
Данная методика позволяет определять содержание охратоксина А в концентрациях от 0,5 до 100 мкг/дм3.
3. Пробоподготовка
Подготовка проб включает следующие этапы:
- извлечение (экстракция) охратоксина А из пробы;
- очистка и концентрирование экстракта;
- подготовка пробы для ввода в хроматограф.
Для анализа готовят две параллельные пробы.
Блок-схема процедуры пробоподготовки
4. Проведение хроматографического анализа
4.1. Оборудование и условия для проведения ВЭЖХ-анализа градуировочных растворов охратоксина А и подготовленной пробы
Для хроматографического определения охратоксина А необходимо использовать изократическую высокоэффективную жидкостную хроматографическую систему с флуориметрическим детектором.
Для проведения анализа предварительно готовят градуировочные растворы охратоксина А в смеси ацетонитрил – раствор аммония хлористого; проводят пробоподготовку; подготавливают к работе прибор.
Оборудование:
- хроматограф жидкостный «Стайер М» с флуориметрическим детектором;
- персональный компьютер с установленным программным обеспечением «МультиХром».
Условия:
- изократический режим;
- колонка: «Synergi Hydro-RP» 4 мкм 250х4,6 мм (Phenomenex, США);
- защитная колонка: «С18 Aq» или «С18» 4x3,0 мм (Phenomenex, США);
- подвижная фаза: раствор аммония хлористого молярной концентрации 20 ммоль/дм3, pH 9,6–9,8 – ацетонитрил (86:14);
- скорость потока: 0,75 см3/мин;
- объем петлевого дозатора: 20 мкл;
- температура: комнатная;
- детектирование: флуориметрическое, λex 365±2 нм, λem 400-460 нм; уровень чувствительности детектора (RFU) – 0,005.
Градуировку проводят по градуировочным растворам во всем диапазоне измеряемых концентраций не реже 1 раза в 2 недели, а также при использовании новой партии реактивов, замене колонок и после ремонта хроматографа.
4.2. Определение количественного содержания охратоксина А в пробе
Для определения количественного содержания охратоксина А необходимо провести анализ двух параллельных проб, для каждой из которых выполнить по два измерения (получить по две хроматограммы). Массовая концентрация (Схр) охратоксина А в пробе, введенной в хроматограф, рассчитывается автоматически системой сбора и обработки хроматографической информации. По результатам двух измерений для каждой из параллельных проб рассчитывают среднее арифметическое значение массовой концентрации охратоксина А.
Если массовая концентрация пробы, введенной в хроматограф, оказывается больше верхней границы диапазона градуировки (100 нг/дм3), пробу перед вводом в хроматограф разбавляют подвижной фазой. Разбавление учитывают при расчете.
Массовую концентрацию охратоксина А в анализируемой пробе продукта Х, [мкг/дм3] рассчитывают по формуле:
где:
Схр – среднее значение массовой концентрации охратоксина А в пробе, введенной в хроматограф [нг/см3];
Vпр – объем пробы [см3];
Vконц – объем пробы после концентрирования [см3];
Kэкстр – коэффициент первичной жидкостной экстракции этилацетатом.
За результат измерений принимают среднее арифметическое значение массовой концентрации охратоксина А в двух параллельных пробах.
1. Основное оборудование
Хроматограф жидкостный «Стайер М» по ТУ 4215-032-81696414-12 в составе:
- насос изократический в стальном исполнении (SS 316);
- детектор флуориметрический DFL-203;
- устройство ввода образца (ручной инжектор или автосамплер);
- дозатор петлевой объемом 20 мкл
- необходимый стартовый набор капилляров, фитингов и уплотнений для сборки системы и обеспечения работы в течение гарантийного периода (в стальном исполнении);
- шприц дозирующий Hamilton для ввода образца объёмом 100 мкл;
- аналитическая колонка «Synergi Hydro-RP» 250х4,6 мм 4 мкм в комплекте с защитной колонкой «C18» или «С18 Aq» 4х3,0 мм и держателем (Phenomenex);
- программное обеспечение для сбора и обработки данных «МультиХром».
2. Вспомогательное оборудование и оборудование для пробоподготовки
- Персональный компьютер (процессор Intel Core i3 или более производительный, объём оперативной памяти не менее 8 Гб, последовательный порт или MOXA) с установленной операционной системой Windows 10, монитор, лазерный принтер.
- Термостат колонок TSС-003;
- Устройство для фильтрации и дегазации растворов и фильтры мембранные (тефлоновые, PTFE). Предназначены для подготовки подвижной фазы в хроматографическом анализе, подключаются к водоструйному или вакуумному насосу.
- Насос вакуумный, обеспечивающий разряжение не менее 400 мм рт. ст. и способный работать с органическими растворителями (например, мининасос-компрессор KNF модель N 86 KT 18).
- Фильтрующая насадка на шприц ProFill для предварительной фильтрации экстракта образца, нейлон, 0.45 мкм, диаметр 30 мм.
-
3. Общелабораторное оборудование
- Аналитические весы предел взвешивания 200 г, цена деления 0.1 мг с внешней калибровкой (например, весы аналитические AR214).
- УЗ ванна объемом не менее 5 л, с таймером, и возможностью нагрева, диапазон частоты 20 – 40 кГц, суммарная полезная мощность усилителя не менее 50 Вт (например, «Сапфир»).
- Центрифуга со скоростью вращения ротора не менее 8000 об/мин (например, ОПН-8 с ротором РУ-180Л).
- Встряхиватель пробирок Вортекс V-3, скорость вращения гнезда 100-2300 мин-1.
- Мешалка магнитная (например, MST (VELP) с мешальником).
- Дистиллятор (например, ДЭ-4).
- Устройство для отдувки образцов в токе воздуха (концентратор испарительный) ECTS10.
- Компрессор безмаслянный производительность от 100 л/ч (например, FX 150-50).
- рН-метр (например, pH 410 c комбинированным электродом.
- Комплект лабораторной посуды:
| № п/п | Описание | Коли- чество |
|---|---|---|
| 1 | Пипетки мерные лабораторные стеклянные по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29169 2-го класса точности вместимостью 1,0 см3 5,0 см3 |
3 шт. 11 шт. |
| 2 | Колбы мерные наливные по ГОСТ 1770 2-го класса точности вместимостью 10 см3 25 см3 50 см3 100 см3 1000 см3 |
1 шт. 1 шт. 6 шт. 2 шт. 2 шт. |
| 3 | Цилиндр мерный по ГОСТ 1770 2-го класса точности вместимостью 25 см3 50 см3 200 см3 |
2 шт. 2 шт. 1 шт. |
| 4 | Стакан лабораторный стеклянный В-1-800 вместимостью 1000 см3 | 1 шт. |
| 5 | Пробирка мерная стеклянная градуированная с узким дном по ГОСТ 1770 2-го класса точности вместимостью 10 см3 | 2 шт. |
| 6 | Пробирки мерные стеклянные градуированные со шлифом № 14 вместимостью 10 см3 | 2 шт. |
| 7 | Пробки пришлифованные 14/23 | 2 шт. |
| 8 | Пробирки центрифужные вместимостью не менее 10 см3 | 2 шт. |
| 9 | Стеклянная ёмкость для подвижной фазы объемом 1000 см3 | 1 шт. |
| 10 | Ёмкости (виалы) из темного стекла с герметично закрывающимися крышками объёмом 10 см3 25 см3 |
1 шт. 5 шт. |
| 11 | Шприц медицинский пластиковый двухкомпонентный одноразовый на 10 см3 |
1 шт. |
| 12 | Механическое дозирующее устройство (Pumpipet) | 1 шт. |
| 13 | Пипет-дозатор переменного объема 200-1000 мм3 в комплекте с наконечниками (1000 шт) | 1 шт. |
4. Комплект реактивов на 20 или 100 определений
| № п/п |
Описание | Количество на 20 определений |
Количество на 100 определений |
|---|---|---|---|
| 1 | Ацетонитрил УФ 210, х.ч. | 1 кг | 2 кг |
| 2 | Тетрагидрофуран, х.ч. * | 0,5 кг | 1 кг |
| 3 | Тетрагидрофуран для ВЭЖХ, о.с.ч., по ТУ 5-02-621-81, массовая доля тетрагидрофурана – 99,9% | 45 г | 70 г |
| 4 | Толуол, о.с.ч., по ТУ 6-09-4305-76 массовая доля толуола – 99,9% | 200 г | 1000 г |
| 5 | Аммоний хлористый, ч., по ГОСТ 3773-71 | 2 г (мин. фасовка) | 8 г (мин. фасовка) |
| 6 | Аммиак водный, о.с.ч., 25-5, по ГОСТ 24147-80 | 25 г (мин. фасовка) | 50 г (мин. фасовка) |
| 7 | Натрий углекислый, х.ч., по ГОСТ 83-79 | 0,2 г (мин. фасовка) | 0,3 г (мин. фасовка) |
| 8 | Калий двухромовокислый, х.ч., по ГОСТ 4220-75 | 100 г (мин. фасовка) | 200 г (мин. фасовка) |
| 9 | Кислота серная, о.с.ч., по ГОСТ 4204-77 | 1 кг | 2 кг |
| 10 | Ацетон, о.с.ч., по ТУ 6-09-3513-86 | 1 кг | 2 кг |
* Применяется не чаще чем 1 раз на 20 проб для отмывки колонки (в случае необходимости).
5. Комплект стандартных образцов
| № п/п |
Описание | Количество |
|---|---|---|
| 1 | Раствор охратоксина А (СОП 0015-97) в ацетонитриле с аттестованным значением массовой концентрации 50,0 мкг/см3 ± 5% | 1 ампула |
| Название | Колонка | Детектор |
|---|---|---|
| Стандартный раствор охратоксина А | Synergi Hydro-RP 250х4.6 мм 4 мкм | Флуориметрический |
| Охратоксин А в вине | Synergi Hydro-RP 250х4.6 мм 4 мкм | Флуориметрический |
