Выберите параметры для поиска:

Методика выполнения измерений массовой концентрации левомицетина в молоке, мясе и яйцах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Свидетельство №01.00225/4-11 от 25.01.2011, ФР.1.31.2012.13730

1. Объекты исследования

Настоящая методика устанавливает метод измерений массовой концентрации левомицетина (антибиотика) в молоке, мясе и яйцах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

2. Диапазон измерений

Диапазон измерений массовой доли левомицетина – от 0,005 до 0,1 мг/кг. Метрологические характеристики метода указаны в таблице.

Наименование
объекта		 Диапазон измерений
массовой доли
левомицетина,
млн-1
(мг/кг)		 Показатель
точности
(границы
относительной
погрешности),
 ±δ, %,
при Р=0,95		 Показатель
повторяемости
(относительное
среднеквадрати-
ческое отклонение
повторяемости),
σr, %		 Показатель
воспроизводимости
(относительное
среднеквадрати-
ческое отклонение
воспроизводимости),
σR , %		 Предел
повторяемости,
 r, %,
P=0,95, n=2
Молоко,
яйцa		 от 0,005 до 0,010 вкл. 35 9 14 25
св. 0,010 до 0,10 вкл. 22 6 9 17
Мясо от 0,005 до 0,01 вкл. 50 11 17 31
св. 0,010 до 0,10 вкл. 34 6 9 17

 

3. Пробоподготовка

 

Подготовка проб к измерениям включает следующие этапы:

  • извлечение (жидкостная экстракция) левомицетина из пробы;
  • очистка и концентрирование экстракта;
  • подготовка пробы для ввода в хроматограф.

Для анализа готовят две параллельные пробы.

Блок-схема процедуры пробоподготовки

4. Проведение хроматографического анализа

4.1. Оборудование и условия для проведения ВЭЖХ-анализа градуировочных растворов левомицетина и подготовленной пробы

Для хроматографического определения левомицетина необходимо использовать изократическую высокоэффективную жидкостную хроматографическую систему с спектрофотометрическим детектором.

Для проведения анализа предварительно готовят градуировочные растворы левомицетина; проводят пробоподготовку; подготавливают к работе прибор.

Оборудование:

  • хроматограф жидкостный «Стайер М» с спектрофотометрическим детектором;
  • персональный компьютер с установленным программным обеспечением «МультиХром».

Условия:

  • изократический режим;
  • колонка: Gemini С18 3 мкм 150х4,6 мм;
  • защитная колонка: С18 Aq или С18 4x3,0 мм;
  • подвижная фаза: 0,2% водный раствор ортофосфорной кислоты–ацетонитрил (70:30);
  • скорость потока: 0,7 см3/мин;
  • объем петлевого дозатора: 20 мкл;
  • температура: 40°С;
  • детектирование: спектрофотометрическое, длина волны 280 нм.

Градуировку во всем диапазоне измеряемых концентраций проводят не реже 1 раза в месяц, а также при смене колонки и/или защитной колонки, при замене веществ и/или реактивов; после проведения ремонта хроматографа, после длительного простоя хроматографа (2 недели и более), при изменении эффективности хроматографической системы и/или чувствительности детектора.

4.2. Определение количественного содержания левомицетина в пробе

Для получения результата измерений проводят анализ двух параллельных проб, для каждой из которых выполняют по два измерения (получают по две хроматограммы). Результат измерений С (мкг/см3) – массовая концентрация левомицетина в пробе, введенной в хроматограф, рассчитывается автоматически системой сбора и обработки хроматографической информации по площади пика.

Если массовая концентрация пробы, введенной в хроматограф, оказывается больше верхней границы диапазона градуировки (5 мкг/см3), пробу перед вводом в хроматограф разбавляют подвижной фазой. Коэффициент разведения Kразв учитывают при расчете.

Рассчитывают среднее арифметическое значение массовой концентрации левомицетина в пробах, введенных в хроматограф (C1 и C2), по результатам двух измерений для каждой из параллельных проб по формуле

Сср = ( С1 + С2 ) / 2

Массовую долю левомицетина в анализируемой пробе Xпр, [мкг/кг] рассчитывают по формуле:


где:
Сср – среднее значение массовой концентрации левомицетина в пробе, введенной в хроматограф, мкг/см3;
V1 – объем ацетонитрила, взятый для экстракции (10 см3);
V2 – объем экстракта (10 см3);
V3 – объем пробы после концентрирования, см3;
Kразв – коэффициент разведения образца перед введением в хроматограф (при отсутствии разведения равен 1);
Kэкстр – коэффициент извлечения (см. таблицу);
KТФЭ – коэффициент твердофазной экстракции (см. таблицу);
M1 – навеска образца, г.

  Мясо Яйцо Молоко Вода
Kэкстр 0,5 0,45 0,55 0,5
KТФЭ 0,55 0,75 0,9 0,9

За результат измерений принимают среднее арифметическое значение массовой доли левомицетина в двух параллельных пробах.

1. Основное оборудование

Хроматограф жидкостный «Стайер М» по ТУ 4215-032-81696414-12 в составе:

2. Вспомогательное оборудование и оборудование для пробоподготовки

  • Персональный компьютер (процессор Intel Core i3 или более производительный, объём оперативной памяти не менее 8 Гб, последовательный порт или MOXA) с установленной операционной системой Windows 10, монитор, лазерный принтер.
  • Установка для вакуумной фильтрации и дегазации растворов (Phenomenex, США).
  • Насос вакуумный (например, мини насос-компрессор KNF модель N 86 KT 18, производительность - 5,5 л/мин, вакуум - 160 мбар, давление до 2,5 бар, фторопластовая мембрана).
  • Фильтры мембранные фторопластовые (PTFE), диаметр 45 мм, диаметр пор 0,45 мкм (Phenomenex, США).
  • Вакуумная установка для твердофазной экстракции  в комплекте с адаптером и резервуаром (Phenomenex, США).
  • Картриджи для твердофазной экстракции Strata-X 60мг/3мл (Phenomenex, США).

3. Общелабораторное оборудование

  • Весы лабораторные электронные с наибольшим пределом взвешивания 200 г, класс точности специальный, по ГОСТ 24104-2001 (например, весы аналитические RV214).
  • Ванна ультразвуковая ALS, диапазон частоты (20-40) кГц, мощность не менее 50 Вт.
  • Центрифуга «ОПн-8» со скоростью вращения ротора не менее 8000 об/мин и пластиковыми пробирками объемом не менее 20 см3.
  • Встряхиватель пробирок «Вортекс V-3», скорость вращения гнезда не менее 2300 мин–1 (ELMI, Латвия).
  • Блендер Waring 800S со стаканом 250 см3 (США).
  • Пленка укрывная «Парафильм М» шириной 10 см.
  • Комплект лабораторной посуды:
№ п/п Описание Коли-
чество
1 Пипетки мерные лабораторные стеклянные по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29169 2 класса точности, вместимостью
1,0 см3
2,0 см3
10 см3

2 шт.
4 шт.
1 шт.
2 Колбы мерные наливные 2 класса точности по ГОСТ 1770 вместимостью
50 см3
100 см3
250 см3
500 см3
1000 см3
3 шт.
4 шт.
1 шт.
1 шт.
1 шт.
3 Цилиндры мерные 2 класса точности по ГОСТ 1770 вместимостью
10 см3
250 см3
3 шт.
2 шт.
4 Стаканы стеклянные с носиком по ГОСТ 25336-82 вместимостью
100 см3
250 см3
1 шт.
1 шт.
5 Пробирки типа Эппендорф, градуированные, с крышкой, 1.5 мл 2 шт.
6 Пробирка центрифужная 20 см3 для ротора РУ-180Л. 3 шт.
7 Стеклянная емкость для подвижной фазы объемом 500 или 1000 см3 1 шт.
8 Палочка стеклянная 2 шт.

 

4. Реактивы

  • Ацетонитрил (УФ-200 или УФ-210) для ВЭЖХ, квалификации «о.с.ч.» по ТУ 6-09-14-2167.
  • Кислота ортофосфорная для электронной промышленности или квалификации «ч.д.а.».
  • Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

5. Стандартные образцы

  • Левомицетин (РСО 9348-152-00494189-06) или Сloramphenicol (Sigma, кат. номер C0857) с массовой долей 99%.

_storage_files_methodologies_ru_0_239_33_3s.00225.4-11.jpg

Название Колонка Детектор
Левомицетин стандарт Gemini C18 150x4.6 мм 3 мкм Спектрофотометрический
Левомецитин в яйце Gemini C18 150x4.6 мм 3 мкм Спектрофотометрический
Левомецитин в мясе Gemini C18 150x4.6 мм 3 мкм Спектрофотометрический
Левомицетин в молоке Gemini C18 150x4.6 мм 3 мкм Спектрофотометрический
Миниатюра схемы