Методика выполнения измерений массовой доли жирных кислот в жирах и маслах животных и растительных, маргаринах, жирах для кулинарии, кондитерской и хлебопекарной промышленности методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

1. Объекты исследования

Настоящая методика устанавливает процедуру измерений массовой доли жирных кислот в жирах и маслах животных и растительных, маргаринах, жирах для кулинарии, кондитерской и хлебопекарной промышленности методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Метод основан на разрушении сложноэфирных связей триглицеридов пробы посредством щелочного гидролиза с высвобождением жирных кислот и, после хроматографического разделения в изократическом режиме, последующем их детектировании при помощи низкотемпературного детектора светорассеяния.

2. Диапазон измерений

Диапазон измерения массовой доли жирных кислот, определяемых по МВИ:

• лауриновая кислота: 12–96 %;
• миристиновая кислота: 5–50 %;
• линолевая кислота: 5–50 %;
• пальмитиновая кислота: 5–50 %;
• олеиновая кислота: 5–50 %;
• стеариновая кислота: 5–50 %.

3. Пробоподготовка

Подготовка проб к измерениям включает следующие этапы:

• щелочной гидролиз сложноэфирных связей триглицеридов анализируемого продукта с высвобождением жирных кислот;
• отбор аликвоты гидролизата;
• подготовка пробы для ввода в хроматограф.

Для анализа готовят две параллельные пробы.

Блок-схема процедуры пробоподготовки

4. Проведение хроматографического анализа

4.1. Оборудование и условия для проведения ВЭЖХ-анализа градуировочных растворов жирных кислот и подготовленных проб

Для хроматографического разделения жирных кислот необходимо использовать изократическую ВЭЖХ систему с детектированием по светорассеиванию.

Для проведения анализа предварительно готовят раствор элюента (подвижной фазы), градуировочные растворы из навесок кислот; проводят пробоподготовку; подготавливают к работе прибор.

Оборудование:

• хроматограф жидкостный «Стайер М» с детектором светорассеяния низкотемпературным испарительным модель 80;
• персональный компьютер с установленным программным обеспечением «МультиХром».

Условия:

• изократический режим;
• колонка: «Synergi Fusion-RP» 250х4,6 мм 4 мкм (Phenomenex, США);
• защитная колонка: «Synergi Fusion-RP» 4х3,0 мм (Phenomenex, США);
• подвижная фаза: раствор ацетонитрил–вода–CH₃COOH (110:12:3 об.ч.);
• скорость потока: 0,9 мл/мин;
• температура: 20 °С;
• объем петлевого дозатора: 10 мкл;
• детектирование: по светорассеянию; температура испарительной трубки: +40°C; давление газа на входе в детектор: 3,0 бар; коэффициент усиления выходного сигнала: 1,0.

В связи со специфическими физико-химическими свойствами жирные кислоты при их детектировании методом светорассеяния вызывают нелинейный отклик сигнала детектора в определяемом диапазоне концентраций. По этой причине при градуировке хроматографа аппроксимацию полученных данных производят с использованием квадратичной зависимости вида Y = k₂X²+ k₁X + k₀.

Контроль стабильности градуировочной характеристики выполняют перед началом работ в день выполнения измерений. Регистрируют не менее двух хроматограмм. При отклонении среднего значения результатов измерений градуировочного раствора более чем на 10% от значения соответствующего данному раствору по градуировочной характеристике и/или изменении времен удерживания более чем на 5% от значений текущей градуировки, повторную градуировку хроматографа выполняют во всем диапазоне измерений. Градуировку во всем диапазоне измеряемых концентраций проводят также для каждой новой партии реактивов, при замене колонки и после ремонта хроматографа.

4.2. Определение массовой доли жирных кислот в пробе

Для получения окончательного результата измерений необходимо провести анализ двух параллельных проб, для каждой из которых выполнить по два измерения (получить по две хроматограммы).

Результат измерений (С_i) – массовая концентрация i-ой жирной кислоты в пробе, введенной в хроматограф [мг/см³], рассчитывается автоматически системой сбора и обработки хроматографической информации. За результат измерений принимают среднее арифметическое значение из двух параллельных измерений.

Если массовая концентрация пробы, введенной в хроматограф, оказывается больше верхней границы диапазона градуировки, пробу перед вводом в хроматограф разбавляют. Верхняя граница диапазона градуировки составляет: для лауриновой кислоты – 16 мг/см³, для миристиновой, линолевой, олеиновой, пальмитиновой и стеариновой кислот – 8 мг/см³. Разбавление учитывают при расчете.

Массовую долю i-ой жирной кислоты в рабочей пробе (Х_i,м.д.), г/кг, рассчитывают по формуле:

, где:

C_i – среднее значение массовой концентрации i-ой жирной кислоты в пробе, введенной в хроматограф [мг/см³];
V_х – объем пробы, подготовленной для анализа [см³];
m_пр – масса пробы продукта [г];
m_нав – масса навески эмульсии [г].
m_гидр – масса гидролизата пробы [г].

m_гидр = m_{К,М,гидр} – m_к+м, где
m_{К,М,гидр} – масса колбы, мешальника и реакционной смеси [г];
m_к+м – масса колбы и мешальника [г].

Пересчет результатов анализа из [г/кг] в [%] осуществляют по формуле: