Методика выполнения измерений массовой доли лизина, триптофана, метионина, суммы цистина и цистеина в комбикормах, премиксах и комбикормовом сырье методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Свидетельство №28-08 от 04.03.2008 ФР.1.31.2008.04632

1. Объекты исследования

Настоящая методика выполнения измерений распространяется на корма, комбикорма, комбикормовое сырье, кормовые добавки и устанавливает определение массовой концентрации свободных аминокислот (лизина, триптофана, метионина, цистина) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с предколоночной дериватизацией и спектрофотометрическим детектированием.

2. Диапазон измерений

Метод обеспечивает получение результатов измерений массовой концентрации лизина, триптофана, метионина и цистина при их содержании в кормах от 1 г/кг.

3. Пробоподготовка

Отбор проб проводят методом квартования.

Пробоподготовка состоит из этапов отбора пробы; измельчения пробы в ступке; просеивания, высушивания до постоянного веса; экстракции навески водой дистиллированной в центрифужной пробирке под действием ультразвука и последующего центрифугирования; декантации надосадочного слоя, повторной экстракции дистиллированной водой нижнего слоя; объединения надосадочных слоев, их центрифугирования и последующего фильтрования через фильтрующую насадку на шприц Nylon 0,45 мкм с помощью одноразового пластикового шприца; дериватизации* фильтрата раствором дабсил-хлорида (DABS-Cl).

* Дериватизация: смешивают равные объемы отфильтрованного экстракта и 0,2М раствора натрия углекислого кислого (экстракт – 0,2М NaHCO3, 1:1) под действием ультразвука (в стеклянной пробирке или в пробирке типа «Эппендорф»). Для получения дабсильных производных аликвоту полученной смеси смешивают с раствором DABS-Cl в соотношении 1:1 по объему (под действием ультразвука) до образования гомогенной массы.

Блок-схема процедуры пробоподготовки

4. Проведение хроматографического анализа

4.1. Оборудование и условия для проведения ВЭЖХ-анализа градуировочных растворов аминокислот, подготовленной пробы продукта.

Для хроматографического анализа аминокислот необходимо использовать изократическую высокоэффективную жидкостную хроматографическую систему со спектрофотометрическим детектированием.

Для проведения анализа предварительно готовят рабочие растворы из сухих навесок лизина, триптофана, метионина и цистина*, далее готовят градуировочные растворы путем дериватизации рабочих растворов** раствором DABS-Cl; проводят пробоподготовку; подготавливают к работе прибор.

* Цистин ограниченно растворим в воде (растворимость не более 0,1 г/л).

** Дериватизация: смешивают равные объемы рабочего раствора и 0,2М раствора натрия углекислого кислого (экстракт – 0,2М NaHCO3, 1:1) под действием ультразвука (в стеклянной пробирке или в пробирке типа «Эппендорф»). Для получения дабсильных производных полученную смесь смешивают с раствором DABS-Cl в соотношении 1:1 (по объему) в пробирке типа «Эппендорф» под действием ультразвука. Пробирку помещают в сушильный шкаф, предварительно разогретый до 70 °С, на 15 минут.

Оборудование:

  • хроматограф жидкостный «Стайер М» с спектрофотометрическим детектором;
  • персональный компьютер с установленным программным обеспечением «МультиХром».

Условия:

  • градиентный режим;
  • колонка: Synergi Fusion-RP 250х4,6 мм 4 мкм (Phenomenex, США);
  • защитная колонка: Fusion-RP 4x3,0 мм (Phenomenex, США);
  • подвижная фаза:
    А: ацетонитрил 25мМ,
    В: раствор трехводного ацетата натрия в воде,
    рекомендуемая программа градиента подвижной фазы приведена в таблице 1;
  • скорость потока: 1,0 мл/мин;
  • объем петли: 20 мкл;
  • температура: 20°С;
  • детектирование: спектрофотометрическое, длина волны детектирования: 436 нм.

Таблица 1. Программа градиента подвижной фазы

Время
элюирования, мин
Соотношение растворов в подвижной фазе, %
  раствор А раствор В
0 71 29
6 68 32
15 68 32
22 60 40
35 60 40
36 5 95
40 5 95
41 71 29
45 71 29

Градуировку проводят по градуировочным растворам (во всем диапазоне определяемых концентраций) не реже 1 раза в квартал, а также при использовании новой партии реактивов, замене колонок и после ремонта хроматографа.

4.2. Определение количественного содержания аминокислот в пробе продукта.

Для определения количественного содержания компонентов пробы продукта (лизина, триптофана, метионина, цистина) проводят хроматографический анализ одного из градуировочных растворов и далее хроматографический анализ подготовленной пробы. Для достоверности измерений хроматографический анализ как градуировочного раствора, так и подготовленной пробы проводят не менее 2 раз подряд.

Используя установленное программное обеспечение – «МультиХром для Windows XP» в отчете или над пиком (в зависимости от установок опций «ВИД») по окончании измерения автоматически определяется результат в виде концентрации в пробе, введенной в хроматограф (но не в исходном образце, взятом для исследования!).

Для получения результата необходимо провести как минимум два параллельных измерения (получить две хроматограммы). За результат измерений принимают среднее арифметическое значение содержания аминокислоты в анализируемой пробе Cхр, г/л (рассчитывается из двух значений массовой концентрации аминокислоты в анализируемой пробе С1 и С2).
Массовую концентрацию аминокислоты в анализируемой пробе (в исходном образце) Х (г/л) рассчитывают по формуле:

X = 50·Схр

где:
Схр – среднее значение концентрации аминокислоты, полученное в результате хроматографирования в двух параллельных измерениях [г/л];
50 – коэффициент, учитывающий массу навески (0,200 г); объем дистиллированной воды, пошедшей на экстракцию (10 мл), объем экстракта, подвергнутого дериватизации (0,1 мл).

1. Основное оборудование

Хроматограф жидкостный «Стайер М» по ТУ 4215-032-81696414-12 в составе:

2. Вспомогательное оборудование и оборудование для пробоподготовки

  • Персональный компьютер (процессор Intel Core i3 или более производительный, объём оперативной памяти не менее 8 Гб, последовательный порт или MOXA) с установленной операционной системой Windows 10, монитор, лазерный принтер.
  • Устройство для фильтрации и дегазации растворов и фильтры мембранные (нейлоновые и тефлоновые). Предназначены для подготовки подвижной фазы в хроматографическом анализе, подключаются к водоструйному или вакуумному насосу.
  • Насос вакуумный, обеспечивающий разряжение не менее 400 мм рт. ст. и способный работать с органическими растворителями (например, мининасос-компрессор KNF модель N 86 KT 18).
  • Фильтрующая насадка на шприц Nylon 0,45 мкм диаметр 17 мм (Phenomenex) для предварительной фильтрации образца допускается использование фильтров типа “Синяя лента”).
  • Измельчитель (блендер) 22000 об/мин с объемом стакана 250 мл (например, “Waring”), либо лабораторная мельница, либо ступка фарфоровая с пестиком.
  • Сито с размером пор 0,5 мм диаметром не менее 100 мм из капроновой или металлической сетки.

3. Общелабораторное оборудование

  • Аналитические весы предел взвешивания 200 г, цена деления 0.1 мг с внешней калибровкой (например, весы аналитические AR2140).
  • УЗ ванна объемом не менее 5 л, с таймером, и возможностью нагрева, диапазон частоты 20 – 40 кГц, суммарная полезная мощность усилителя не менее 50 Вт (например, «Сапфир»).
  • Центрифуга со скоростью вращения ротора не менее 8000 об/мин (например ОПН-8, ротор РУ-180Л).
  • Дистиллятор.
  • pH-метр HI 9321 с микроэлектродом HI 1083 или аналогичный.
  • Сушильный шкаф, способный поддерживать температуру 70°С.
  • Комплект лабораторной посуды:
№ п/п Описание Коли-
чество
1 Пипетки мерные лабораторные стеклянные по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29169 2-го класса точности вместимостью
1,0 см3
2,0 см3
5,0 см3
10,0 см3


5 шт.
5 шт.
5 шт.
5 шт.
2 Микропипетки мерные градуированные стеклянные вместимостью
0,1 см3
0,2 см3

1 шт.
1 шт.
3 Колбы мерные наливные по ГОСТ 1770 2-го класса точности вместимостью
10 см3
100 см3
500 см3
1000 см3

3 шт.
1 шт.
2 шт.
2 шт.
4 Пробирка мерная стеклянная градуированная с узким дном по ГОСТ 1770 2-го класса точности вместимостью 10 см3 1 шт.
5 Стеклянная емкость для подвижной фазы объемом 500 см3 2 шт.
6 Пробирки типа “Эппендорф” 5 шт.
7 Шприц медицинский пластиковый двухкомпонентный одноразовый
на 10 мл
1 шт.
8 Механическое дозирующее устройство (Pumpipet) 1 шт.
9 Пипет-дозатор переменного объема 20-200 мм3 в комплекте с наконечниками (1000 шт) 1 шт.
10 Пипет-дозатор переменного объема 200-1000 мм3 в комплекте с наконечниками (1000 шт) 1 шт.

 

4. Комплект реактивов на 20 или 100 определений


п/п
Описание Количество
на 20
определений
Количество
на 100
определений
1 Ацетонитрил УФ 210, х.ч. 2 кг 10 кг
2 Ацетон, х.ч. 1 кг 1 кг
3 DABS-Cl (Дабсилхлорид) Sigma 3 г (мин. фасовка) 10 г (мин. фасовка)
4 Натрий углекислый кислый, х.ч. 61 г (мин. фасовка) 300 г (мин. фасовка)
5 Натрий уксуснокислый трехводный, х.ч. 25 г (мин. фасовка) 120 г (мин. фасовка)

 

5. Комплект стандартных образцов


п/п
Описание Количество
1 Стандартные сухие аминокислоты (триптофан, лизин, цистеин, метионин) производства фирмы Sigma или аналогичные  

_storage_files_methodologies_ru_0_172_1_1s.jpg

Название Колонка Детектор
Аминокислоты в комбикорме Synergi Fusion-RP 250х4.6 мм 4 мкм Спектрофотометрический
Стандартная смесь аминокислот 1 Synergi Fusion-RP 250х4.6 мм 4 мкм Спектрофотометрический
Стандартная смесь аминокислот 2 Synergi Fusion-RP 250х4.6 мм 4 мкм Спектрофотометрический
Миниатюра схемы