Методика выполнения измерений массовой доли лизина, триптофана, метионина, суммы цистина и цистеина в комбикормах, премиксах и комбикормовом сырье методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

1. Объекты исследования

Настоящая методика выполнения измерений распространяется на корма, комбикорма, комбикормовое сырье, кормовые добавки и устанавливает определение массовой концентрации свободных аминокислот (лизина, триптофана, метионина, цистина) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с предколоночной дериватизацией и спектрофотометрическим детектированием.

2. Диапазон измерений

Метод обеспечивает получение результатов измерений массовой концентрации лизина, триптофана, метионина и цистина при их содержании в кормах от 1 г/кг.

3. Пробоподготовка

Отбор проб проводят методом квартования.

Пробоподготовка состоит из этапов отбора пробы; измельчения пробы в ступке; просеивания, высушивания до постоянного веса; экстракции навески водой дистиллированной в центрифужной пробирке под действием ультразвука и последующего центрифугирования; декантации надосадочного слоя, повторной экстракции дистиллированной водой нижнего слоя; объединения надосадочных слоев, их центрифугирования и последующего фильтрования через фильтрующую насадку на шприц Nylon 0,45 мкм с помощью одноразового пластикового шприца; дериватизации* фильтрата раствором дабсил-хлорида (DABS-Cl).

* Дериватизация: смешивают равные объемы отфильтрованного экстракта и 0,2М раствора натрия углекислого кислого (экстракт – 0,2М NaHCO3, 1:1) под действием ультразвука (в стеклянной пробирке или в пробирке типа «Эппендорф»). Для получения дабсильных производных аликвоту полученной смеси смешивают с раствором DABS-Cl в соотношении 1:1 по объему (под действием ультразвука) до образования гомогенной массы.

Блок-схема процедуры пробоподготовки

4. Проведение хроматографического анализа

4.1. Оборудование и условия для проведения ВЭЖХ-анализа градуировочных растворов аминокислот, подготовленной пробы продукта.

Для хроматографического анализа аминокислот необходимо использовать изократическую высокоэффективную жидкостную хроматографическую систему со спектрофотометрическим детектированием.

Для проведения анализа предварительно готовят рабочие растворы из сухих навесок лизина, триптофана, метионина и цистина*, далее готовят градуировочные растворы путем дериватизации рабочих растворов** раствором DABS-Cl; проводят пробоподготовку; подготавливают к работе прибор.

* Цистин ограниченно растворим в воде (растворимость не более 0,1 г/л).

** Дериватизация: смешивают равные объемы рабочего раствора и 0,2М раствора натрия углекислого кислого (экстракт – 0,2М NaHCO₃, 1:1) под действием ультразвука (в стеклянной пробирке или в пробирке типа «Эппендорф»). Для получения дабсильных производных полученную смесь смешивают с раствором DABS-Cl в соотношении 1:1 (по объему) в пробирке типа «Эппендорф» под действием ультразвука. Пробирку помещают в сушильный шкаф, предварительно разогретый до 70 °С, на 15 минут.

Оборудование:

• хроматограф жидкостный «Стайер М» с спектрофотометрическим детектором;
• персональный компьютер с установленным программным обеспечением «МультиХром».

Условия:

• градиентный режим;
• колонка: Synergi Fusion-RP 250х4,6 мм 4 мкм (Phenomenex, США);
• защитная колонка: Fusion-RP 4x3,0 мм (Phenomenex, США);
• подвижная фаза:
  А: ацетонитрил 25мМ,
  В: раствор трехводного ацетата натрия в воде,
  рекомендуемая программа градиента подвижной фазы приведена в таблице 1;
• скорость потока: 1,0 мл/мин;
• объем петли: 20 мкл;
• температура: 20°С;
• детектирование: спектрофотометрическое, длина волны детектирования: 436 нм.

Таблица 1. Программа градиента подвижной фазы

Градуировку проводят по градуировочным растворам (во всем диапазоне определяемых концентраций) не реже 1 раза в квартал, а также при использовании новой партии реактивов, замене колонок и после ремонта хроматографа.

4.2. Определение количественного содержания аминокислот в пробе продукта.

Для определения количественного содержания компонентов пробы продукта (лизина, триптофана, метионина, цистина) проводят хроматографический анализ одного из градуировочных растворов и далее хроматографический анализ подготовленной пробы. Для достоверности измерений хроматографический анализ как градуировочного раствора, так и подготовленной пробы проводят не менее 2 раз подряд.

Используя установленное программное обеспечение – «МультиХром для Windows XP» в отчете или над пиком (в зависимости от установок опций «ВИД») по окончании измерения автоматически определяется результат в виде концентрации в пробе, введенной в хроматограф (но не в исходном образце, взятом для исследования!).

Для получения результата необходимо провести как минимум два параллельных измерения (получить две хроматограммы). За результат измерений принимают среднее арифметическое значение содержания аминокислоты в анализируемой пробе C_хр, г/л (рассчитывается из двух значений массовой концентрации аминокислоты в анализируемой пробе С₁ и С₂).
Массовую концентрацию аминокислоты в анализируемой пробе (в исходном образце) Х (г/л) рассчитывают по формуле:

X = 50·С_хр

где:
С_хр – среднее значение концентрации аминокислоты, полученное в результате хроматографирования в двух параллельных измерениях [г/л];
50 – коэффициент, учитывающий массу навески (0,200 г); объем дистиллированной воды, пошедшей на экстракцию (10 мл), объем экстракта, подвергнутого дериватизации (0,1 мл).