Методика выполнения измерений массовой доли бенз(а)пирена в пищевых продуктах, продовольственном сырье, пищевых добавках методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Свидетельство №30-08 от 04.03.2008 ФР.1.31.2008.01033

1. Объекты исследования

Настоящая методика выполнения измерений распространяется на копченые мясные, копченые рыбные и жировые продукты и устанавливает определение массовой концентрации бенз(а)пирена методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуориметрическим детектированием.

2. Диапазон измерений

ПДК бенз(а)пирена в жировых, копченых мясных, копченых рыбных продуктах составляет 1 мкг/кг.

Метод обеспечивает получение результатов измерений массовой концентрации бенз(а)пирена в диапазонах, представленных в таблице 1.

Таблица 1. Диапазоны измерения массовой концентрации бенз(а)пирена

Вид продукции Диапазон массовой
концентрации, мкг/кг
ПДК,
мкг/кг
жировые продукты 0,5 – 2,0 1,0
копченые мясные продукты 0,5 – 2,0 1,0
копченые рыбные продукты 0,5 – 2,0 1,0

3. Пробоподготовка

Отбор, консервация и хранение проб продукции проводится в соответствии с ГОСТ 7631, ГОСТ 9792, ТУ и другой нормативной документацией, регламентирующей отбор проб для конкретных видов продукции.

Пробоподготовка состоит из этапов отбора пробы (пробу предварительно охлаждают при температуре минус 12-18 °С в течение 30 мин), измельчения, гомогенизации с натрием сернокислым безводным, экстракции гомогенизированной пробы гексаном в колбе с использованием УЗ-ванны, самопроизвольного осаждения твердого осадка (в течении 1-2 мин), обезжиривания экстракта в морозильной камере (в цилиндр вносят навеску силикагеля, приливают экстракт, содержимое цилиндра помещают в морозильную камеру), очистки надосадочного гексанового слоя методом неудерживающей твердофазной экстракции (на картриджах Strata Silica Si–1)*, отдувки элюата в токе воздуха или инертного газа.

* Примечание. При концентрации жиров исходного анализируемого продукта менее 5%, к исходному экстракту пробы после вымораживания необходимо добавить небольшое количество элюирующего реагента – этилацетата (0,1 мл к 6 мл очищенного экстракта).

Блок-схема процедуры пробоподготовки

Блок-схема

 

4. Проведение хроматографического анализа

4.1. Оборудование и условия для проведения ВЭЖХ-анализа градуировочных растворов бенз(а)пирена, подготовленной пробы продукта.

Для хроматографического анализа бенз(а)пирена необходимо использовать изократическую высокоэффективную жидкостную хроматографическую систему с флуориметрическим детектированием.

Для проведения анализа предварительно готовят градуировочные растворы из ГСО раствора бенз(а)пирена в гексане или из ГСО раствора бенз(а)пирена в ацетонитриле (растворитель отдувают, перерастворяют стандартный образец в гексане); проводят пробоподготовку; подготавливают к работе прибор.

Оборудование:

  • хроматограф жидкостный «Стайер М» с флуориметрическим детектором;
  • персональный компьютер с установленным программным обеспечением «МультиХром».

Условия:

  • изократический режим;
  • колонка: Luna С18(2) 150х3,0 мм 3 мкм (Phenomenex, США);
  • защитная колонка: С18 4x3,0 мм (Phenomenex, США);
  • подвижная фаза: раствор ацетонитрил/вода (75:25);
  • скорость потока: 0,3 мл/мин;
  • объем петли: 10 мкл;
  • температура: 50°С;
  • диапазон RFU: 0,01;
  • детектирование: флуориметрическое (λex: 365±2 нм; λem: 400-460 нм).

Градуировку проводят по градуировочным растворам (во всем диапазоне определяемых концентраций) не реже 1 раза в две недели, а также при использовании новой партии реактивов, замене колонок и после ремонта хроматографа.

4.2. Определение количественного содержания бенз(а)пирена в пробе продукта.

Для определения количественного содержания компонента пробы продукта (бенз(а)пирена) проводят хроматографический анализ одного из градуировочных растворов и далее хроматографический анализ подготовленной пробы. Для достоверности измерений хроматографический анализ как градуировочного раствора, так и подготовленной пробы проводят не менее 2 раз подряд.

При использовании программного обеспечения «МультиХром» в отчете или над пиком (в зависимости от установок опций «ВИД») по окончании измерения автоматически определяется результат в виде концентрации в пробе, введенной в хроматограф (но не в исходном образце, взятом для исследования!).

Для получения результата необходимо провести как минимум два параллельных измерения (получить две хроматограммы). За результат измерений принимают среднее арифметическое значение содержания бенз(а)пирена в концентрате анализируемой пробы Cхр, мкг/л (рассчитывается из двух значений массовой концентрации бенз(а)пирена в концентрате анализируемой пробы С1 и С2).
Массовую долю бенз(а)пирена в анализируемой пробе (в исходном образце) Х, мкг/кг рассчитывают по формуле:

где:
Схр – среднее значение концентрации бенз(а)пирена, полученное в результате хроматографирования в двух параллельных измерениях [нг/мл];
V1 – объем исходного экстракта, фактически равный объему гексана, взятого для первичной экстракции (50 мл);
V2 – объем экстракта (часть исходного), взятого на вымораживание (30 мл);
V3 – объем экстракта (часть экстракта после вымораживания), взятого для проведения ТФЭ (6 мл) [мл];
V5 – объем конечного экстракта, часть из которого вводится в хроматограф (около 3 мл) [мл];
Kпробоотбора – коэффициент пробоотбора, учитывающий долю массы пробы продукта (в смеси с сульфатом натрия) взятого для экстракции, от общей массы пробы, взятой на анализ. Во всех случаях равен 0,736;
Kвымораживания – коэффициент потерь бенз(а)пирена при вымораживании. Для всех категорий исследуемых продуктов этот коэффициент одинаков и равен 0.95;
Kэкстр.1 – коэффициент первичной жидкостной экстракции гексаном. Для всех категорий исследуемых продуктов одинаков и равен 0.95;
KТФЭэкстр.2 – коэффициент твердофазной экстракции бенз(а)пирена, равен 0,95;
mпр. – почвы или грунта, взятой на анализ [г].

1. Основное оборудование

Хроматограф жидкостный «Стайер М» по ТУ 4215-032-81696414-12 в составе:

2. Вспомогательное оборудование и оборудование для пробоподготовки

  • Персональный компьютер (процессор Intel Core i3 или более производительный, объём оперативной памяти не менее 8 Гб, последовательный порт или MOXA) с установленной операционной системой Windows 10, монитор, лазерный принтер.
  • Устройство для фильтрации и дегазации растворов и фильтры мембранные (тефлоновые, PTFE). Предназначены для подготовки подвижной фазы в хроматографическом анализе, подключаются к водоструйному или вакуумному насосу.
  • Фильтрующая насадка на шприц PTFE 0,45 мкм диаметр 30 мм (Phenomenex) для предварительной фильтрации образца.
  • Вакуумная установка для твердофазной экстракции (ТФЭ) в комплекте с адаптером и резервуаром.
  • Насос вакуумный, обеспечивающий разряжение не менее 400 мм рт. ст. и способный работать с органическими растворителями (например, мининасос-компрессор KNF модель N 86 KT 18).
  • Картриджи для твердофазной экстракции strata Si-1 500мг/3мл для очистки экстрактов образцов 50 шт. в упаковке (в комплекте на 20 определений – 1 упаковка; в комплекте на 100 определений – 4 упаковки).
  • Камера морозильная, способная поддерживать температуру –12°С и ниже, для удаления из образцов липофильных компонентов (жиров).
  • Измельчитель (блендер) 22000 об/мин с объемом стакана 250 мл (например, Waring).

3. Общелабораторное оборудование

  • Аналитические весы предел взвешивания 200 г, цена деления 0.1 мг с внешней калибровкой (например, весы аналитические AR2140).
  • УЗ ванна объемом не менее 5 л, с таймером, и возможностью нагрева, диапазон частоты 20 – 40 кГц, суммарная полезная мощность усилителя не менее 50 Вт (например, «Сапфир»).
  • Дистиллятор.
  • Устройство для отдувки образцов в токе воздуха (испарительный концентратор).
  • Компрессор безмаслянный производительность от 100 л/ч.
  • Комплект лабораторной посуды:
№ п/п Описание Коли-
чество
1 Пипетки мерные лабораторные стеклянные по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29169 2-го класса точности вместимостью
0,5 см3
1,0 см3
5,0 см3


3 шт.
3 шт.
3 шт.
2 Пипетка мерная градуированная лабораторная концевая стеклянная вместимостью 5,0 мл 1 шт.
3 Колбы мерные наливные по ГОСТ 1770 2-го класса точности вместимостью
10 см3
50 см3
200 см3

3 шт.
2 шт.
1 шт.
4 Цилиндр мерный по ГОСТ 1770 2-го класса точности вместимостью
50 см3
250 см3

3 шт.
1 шт.
5 Цилиндр мерный по ГОСТ 1770 2-го класса точности со шлифом № 14/23 или 19/26 вместимостью 50 см3 1 шт.
6 Пробирка мерная стеклянная градуированная с узким дном по ГОСТ 1770 2-го класса точности вместимостью 10 см3 3 шт.
7 Стакан широкий вместимостью 150 или 200 см3 1 шт.
8 Стеклянная емкость для подвижной фазы объемом 250 см3 1 шт.
9 Емкости (виалы) из темного стекла с герметично закрывающимися крышками объёмом
10 см3
50 см3


3 шт.
2 шт.
10 Палочка стеклянная 1 шт.
11 Шприц медицинский пластиковый двухкомпонентный одноразовый на 5 мл 1 шт.
12 Пробка полиэтиленовая №14/23 или 19/26 1 шт.
13 Механическое дозирующее устройство (Pumpipet) 1 шт.
14 Пипет-дозатор переменного объема 20-200 мм3 в комплекте с наконечниками (1000 шт) 1 шт.
15 Пипет-дозатор переменного объема 200-1000 мм3 в комплекте с наконечниками (1000 шт) 1 шт.

 

4. Комплект реактивов на 20 или 100 определений


п/п
Описание Количество
на 20
определений
Количество
на 100
определений
1 Ацетонитрил УФ 210, х.ч. 1 кг 3 кг
2 Тетрагидрофуран, х.ч. * 0.5 кг 1 кг
3 Этилацетат, х.ч. 5 г
(мин. фасовка)
15 г
(мин. фасовка)
4 н-Гексан, х.ч. 1 кг 5 кг
5 Натрий сернокислый безводный, х.ч. 2 кг
(мин. фасовка)
10 кг
(мин. фасовка)
6 Натрий углекислый, х.ч. 3 г
(мин. фасовка)
15 г
(мин. фасовка)
7 Силикагель (зернение 0,05 – 0,1 мм) 20 г 100 г


* Применяется не чаще чем 1 раз на 20 проб для отмывки колонки (в случае необходимости).

5. Комплект стандартных образцов


п/п
Описание Количество
1 Cтандартный раствор бенз(а)пирена в гексане (100 мкг/мл) или стандартный раствор бенз(а)пирена в ацетонитриле (100 мкг/мл) 1 ампула

_storage_files_methodologies_ru_0_201_15_1s.jpg

Название Колонка Детектор
Бенз(а)пирен в пробе рыбы сырокопченой Luna Luna C18(2) 150х3.0 мм 3 мкм Флуориметрический
Стандартный раствор бенз(а)пирена 1 Luna Luna C18(2) 150х3.0 мм 3 мкм Флуориметрический
Миниатюра схемы